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今天分享一篇发表在 J Extracell Vesicles（2020年IF=14.98）上的文章，名为《Characterization of extracellular vesicles and synthetic nanoparticles with four orthogonal single-particle analysis platforms》[1]（ 四种正交单粒子分析平台对细胞外囊泡和合成纳米粒子的表征）。
根据细胞外囊泡(EVs)的大小、生物发生途径、分离程序、细胞或组织来源和功能等，其亚型的分类已被提出。然而，EV亚型的可重复分类需要单粒子表征技术，包括通过表面分子或分子特征进行表型分析。从这个意义上说，目前对EV亚型的认识可以与20世纪70年代和80年代早期对免疫细胞的认识相比较。大约在那个时候，多路流式细胞术和细胞分选能力被开发出来，允许更精确的鉴定、表征以及免疫细胞亚群的分子和功能图谱。对于更小的生物实体来说，需要使用单粒子技术将异质EV群体划分为定义明确、易于识别的亚群体。
在这项研究中，我们评估了几种粒子类型和单粒子表征平台。我们选择生物和合成粒子。采用多种方法从H9 T淋巴细胞和U937促单核细胞培养液中分离EVs。之所以选择这两种细胞系，是因为它们表达不同水平的CD63和CD81。H9细胞CD81水平高，CD63水平低，U937细胞相反。研究人员还测试了不同尺寸的合成二氧化硅混合物和可溯源的聚苯乙烯微珠，这并不是因为它们可以模拟EVs或作为EVs的参考材料，而是因为它们已知的尺寸和成分，创造了一个“最佳情况”来评估测量颗粒的能力。技术平台为：单粒子干涉反射成像传感(SPIRIS, NanoView) （带荧光功能）、纳米颗粒跟踪分析(NTA, ParticleMetrix) （带荧光功能）、微流控电阻脉冲传感(MRPS, Spectradyne) (没有荧光功能)和纳米流式检测仪(NFCM, NanoFCM) （带荧光功能）。
实验过程：
材料和平台请参见表1，品牌商、部件号和试剂的稀释比例。这些选择不代表任何组织机构的推荐，不一定是最优选择。
一、制备粒子
人细胞系H9 (T淋巴细胞)和U937(单核细胞前)从ATCC购买。细胞用RPMI1640培养基培养，培养基中添加了充足的或除EV的10%热灭活胎牛血清，1% HEPES缓冲液，1%青霉素-链霉素和1% L-谷氨酰胺。
细胞在5% CO2条件下在37℃培养。硅球(SS, NanoFCM)是包含直径68 nm, 91 nm, 113 nm和151 nm的二氧化硅球混合物。分别购买了直径70 nm、90 nm、125 nm和150 nm的聚苯乙烯球(PS，Thermo Fisher)，以同样的浓度混合。
二、 凝胶排阻色谱(SEC)
取每个细胞系共60 ml条件培养基以1000×g 4℃离心5分钟去除细胞和细胞碎片。用Centricon Plus-70离心过滤器(Millipore Sigma)将初始体积浓缩到1.5 ml。尺寸排除色谱(SEC)采用 qEV Automated Fraction Collectors(AFC，Izon)和 qEV original 70 nm columns (Izon)。色谱柱在室温下放置30分钟，用PBS洗涤。在三个柱上分别加0.5 ml浓缩后的培养基，再加PBS收集0.5 ml产物。将3个色谱柱得到的EV富集的部分汇合（每个样本同样操作），用3 kDa MWCO Amicon Ultra-15 Centrifugal Filters 进一步浓缩到1ml。分装成50 ?l用于下游检测。
三、 微分超速离心法(dUC)
取每个细胞系共60 ml条件培养基以1000×g 4℃离心5分钟去除细胞和细胞碎片。再以2000×g 4?C离心10分钟去除额外碎片。将上清液转移到聚丙烯薄壁超离心(UC)管中，并在4?C下使用 swinging bucket rotor(Thermo Scientific，转子AH-629)在10000 × g下离心30分钟，使大EVs聚集。将上清液转移到新的聚丙烯薄壁UC管中，在4℃相同的转子下，10万×g离心70分钟，用1mlPBS重悬，漩涡震荡，放在冰上20分钟。分装成50 ?l用于下游检测。
四、透射电镜(TEM)
10?l新鲜解冻的等份吸附于放光碳包覆400目铜格栅上，2分钟后，用3滴1× tris缓冲盐水(1分钟1滴)快速吸附和漂洗网格。用1%醋酸铀酰(UAT)+ tylose(1% UAT+去离子水(dIH2O)，0.22?m过滤2次)连续滴2滴到网格上进行负染，印迹，然后快速抽吸，用薄层染色剂覆盖样品。 用AMT XR80 CCD(800万像素)在Hitachi 7600 TEM 进行成像。SS和PS用如上方法吸收，但需要先进行5分钟的浮选，并在80kv下使用AMT XR80 CCD(800万像素)在Phillips CM-120 TEM上成像。
五、 免疫印迹(WB)
H9和U937细胞团和分离的EVs用含蛋白抑制剂cocktail的1×RIPA裂解。用Pierce BCA蛋白测定试剂盒对细胞和EV裂解物进行蛋白定量。将5?g的裂解物用4%至15%的标准TGX无染预制凝胶溶解，然后转移到PVDF膜上。一抗分别为抗CD81、CD63、CD9、TSG101、calnexin、BiP/GRP78和GM130。二抗分别为兔抗小鼠IgGk BP-HRP和小鼠抗兔IgGk BP-HRP。使用SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate进行检测，并使用iBright Western Blot (Thermo Fisher)成像系统对印迹进行可视化。
六、 单粒子干涉反射成像(SP-IRIS)
通过 SEC或dUC分离的35?l 9H和U937的EVs孵育缓冲液(IB)1:1稀释，室温下在ExoView R100(NanoView)的芯片上（包被有 anti-human CD81 (JS-81), anti-human CD63 (H5C6), anti-human CD9 (HI9a), and anti-mouse IgG1 (MOPC-21)抗体）孵育16 h，用IB清洗芯片4次，每次3分钟，500 rpm平缓水平搅拌。然后用抗人CD81 (JS-81, CF555)、抗人CD63 (H5C6, CF647)和抗人CD9 (HI9a, CF488A)的荧光抗体cocktail（1:1200 稀释）在IB和阻断缓冲液的1:1混合液中室温孵育1小时。然后只用IB洗1次，用洗涤液洗3次，用漂洗缓冲液洗1次(500 rpm下各3分钟)。芯片在冲洗缓冲液中浸泡两次，每次约5秒，然后以45度角取出，以使液体排出芯片。所有试剂和抗体均由NanoView Biosciences 提供。在ExoView芯片上，SS和PS都用dIH2O稀释（每个抗体捕获点约10000个颗粒）。共35ul稀释后样品溶液在ExoView芯片上孵育，并允许完全干燥。所有芯片都通过干涉反射成像和荧光检测在ExoView扫描仪(NanoView)中进行成像。使用NanoViewer 2.8.10软件(NanoView)对数据进行分析。荧光通道如下:CF555通道230、CF488通道475、CF647通道250(生物颗粒)和CF555通道675、CF488通道600和CF647通道375 (SS和PS)。
七、 纳米颗粒跟踪分析(NTA)
ZetaView QUATT-NTA Nanoparticle Tracking-Video Microscope PMX-420 和 BASIC NTA-Nanoparticle Tracking Video Microscope PMX-120 (Particle Metrix)仪器用于散射和荧光(488 nm)模式的颗粒定量。校准珠和生物样品分别在蒸馏水和PBS中稀释至最终体积为1 ml。散射和荧光测量均进行校准。用于散射模式校准，将100 nm PS珠1:25万稀释。细胞温度保持在25℃。将488 nm的黄绿色荧光球以1:25万稀释，分别测定散射和荧光。为了测量SS和PS的混合物和PS的尺寸分布，样品被稀释到每帧至少可以计数200个颗粒。每个样本都进行重复测量。每次测量之间使用dIH2O洗涤。对于SEC或dUC分离的H9和U937 EVs，通过扫描11个细胞位置进行一个循环。使用ztaview软件8.5.10对录制的视频进行分析。由于粒子的亚群也可以根据信号强度进行识别，我们在ZetaView软件中使用manual and population distribution gates来评估SS和PS混合物的这种可能性。采用PE偶联小鼠抗人CD81和AF488偶联小鼠抗人CD63进行EVs的荧光检测。将抗体与PBS 1:9 混合，室温孵育2小时，稀释至最终体积为1 ml。补充表2列出了该平台检测的所有抗体。
八、 微流控电阻式脉冲传感（MRPS）
使用nCS1仪器(Spectradyne)进行微流控电阻脉冲传感测量。对于生物样本，几微升 H9和U937的EVs用同等体积的1%吐温20+1×PBS (PBST)并进一步用1×PBS稀释，加到polydimethylsiloxane cartridges(直径范围65 nm - 400 nm)。每个样本和重复使用不同的cartridges。使用大约5?l的稀释样品，每次分析记录约25000个颗粒。对于合成的纳米颗粒，SS和PS在dIH2O中按体积稀释100倍，然后用等体积的PBST稀释10倍，剩下的用1×PBS，加入TS-400 polydimethylsiloxane cartridges中。每次记录大约3000个颗粒。所有结果均使用nCS1数据分析仪(Spectradyne)进行分析。对所有样本采用自定义滤波，根据经过时间和直径定义二维多边形边界，以排除假阳性信号，类似于流式细胞术数据分析中常用的圈门。通过将样品在Tween 20(PBS中)稀释到最终浓度 0.1%到 0.9%.，评估Tween 20对EV完整性或计数的影响。
九、 纳米流式检测(NFCM)
nFCM纳米流式检测仪用于测量颗粒的浓度和尺寸。两个单光子计数雪崩光电二极管(APDs)用于同时检测侧面散射(SSC)和单个粒子的荧光。分别使用200 nm PE-和AF488荧光偶联的PS球和二氧化硅纳米球cocktail对仪器进行了校准。分别将20?lEVs 与20?l PE-conjugated CD81抗体和5?l AF488-conjugated CD63抗体37℃孵育30分钟。然后PBS洗两次，110000 g×4℃离心70分钟（TH-641转子，Thermo Fisher）用50?l PBS重悬颗粒。记录1分钟。利用校准曲线，将流速和散射强度转换为相应的颗粒浓度和大小。
十、动态光散射(DLS)
为检验PS球的公称尺寸值，使用Malvern Zetasizer Nano-ZS90用动态光散射法测量了粒径。每种悬液在超纯水中稀释10倍，在25℃条件下进行3次测量。每一次运行只观察到一个峰值。
结果展示：
最后一张图是总结对比。
有兴趣的话可以自己找这篇文献具体看，或者私聊我要文献资料，有理解得不对的地方，欢迎专业人士指正，一起交流~
参考文献：
[1]Arab, T; Mallick, ER; Huang, Y; et al.Characterization of extracellular vesicles and synthetic nanoparticles with four orthogonal single-particle analysis platforms.[J].J Extracell Vesicles.2021,10(6):e12079
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