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专业: 细胞生物学研究中的新方法

[交流] 纳米材料相关研究文献分享,轻松读完一篇文献（一）

今天分享一篇发表在Sensors and Actuators B: Chemical（2020年IF=7.1）上的文章，名为《NIR-II emissive lateral flow immunoassay for accurate determination of tumor marker in hemolysis》[1]（ NIR-II放射侧流免疫分析法用于准确测定溶血样本中肿瘤标志物）。

癌症是全世界范围内一个重大公共健康问题，尤其给贫困国家和发展中国家造成严重负担。由于人口增长和老龄化，癌症死亡率逐年上升，在欠发达国家尤其严重。目前，临床肿瘤标志物的检测主要是通过化学发光平台，但依赖昂贵的设备和试剂，不适合定点检测(POCT)。因此，癌症诊断迫切需求一种更经济实惠、方便、快速、灵敏的诊断工具。

侧向层析检测(Lateral flow assay, LFIA)，又称条带检测，是一种便携、快速的诊断方法，不需要昂贵的设备就可以检测液体样本中的目标分子。侧向流动测试条通常由四部分组成：聚氯乙烯基材、样品垫、包含试验线(T线)和控制线(C线)的硝化棉(NC)膜和吸水垫。LFIA已广泛应用于医学诊断，具有较高的灵敏度，如家用妊娠试纸。近年来，荧光LFIA因其灵敏度高而备受关注。然而，现有的荧光LFIA大多只能检测尿液、血浆等吸收和散射较弱的样品。传统荧光LFIA中使用的荧光探针的激发和发射波长通常在可见范围，容易被许多生物样本吸收和散射，如全血。特别是在溶血样本中，红细胞破裂后释放的血红蛋白不能从血浆中分离出来(通常用于全血提取血细胞和血浆)，对可见荧光检测有很强的干扰。因此，对于溶血样本，即使是溶血血浆，也不可能进行常规荧光LFIA检测。溶血概率高(采集时可达10-31%)，且溶血的发生难以消除，因此建立直接检测溶血样品中目标物的LFIA方法至关重要。

本研究开发了一个快速、高精度、高灵敏度的分析平台，将便携式NIR-II读取器和NIR-II纳米探针(将其命名为“BBTD@PS”)集成到LFIA中。由300 nm羧基聚苯乙烯纳米颗粒(PS)和NIR-II AIE dye of 4,8-Bis[4-(N, N-bis(4octyloxyphenyl)am-ino)phenyl]-benzo[1,2- c:4,5c′]bis([1,2,5]thiadia-zole) (BBTD)组成，在680 nm氙灯激发下可发射960nm的荧光峰值。与可见光(400 ~ 650 nm)相比，血液样本与NIR-II光的相互作用最小，可以显著提高信噪比(通过减少散射、吸收和自荧光)。且BBTD@PS具有优良的光稳定性和长期贮存稳定性。同时，使用自制的NIR-II读取器采集荧光信号，这是迄今为止NIR-II窗口标记侧向流动测试条的首次展示。我们开发的分析平台(NIR-II-LFIA平台)能够准确测定溶血样品中AFP的浓度。NIR-II-LFIA平台消除了信号采集过程中样品矩阵引起的偏差，对溶血样品定量检测的实现具有重要意义。

实验过程：

一、材料

十水四硼酸钠、硼酸、十二烷基硫酸钠(SDS)、乳剂B66 (B66)、Tween 20和四氢呋喃(THF)购自 J&K Scientific LTD。 N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'- ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC), N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt (sulfo-NHS) and bovine serum albumin (BSA)购自Sigma-Aldrich。PVC基、样品垫、硝化棉(NC)膜、吸收垫、AFP校准器、AFP抗原、AFP抗体、人血清白蛋白(HSA)、视黄醇结合蛋白(RBP)抗原、C反应蛋白(CRP)抗原、胱氨酸抑制素C (CYC)抗原、降钙素原(PCT)抗原、血清淀粉样蛋白A (SAA)抗原购自上海捷门生物技术有限公司。所有的化学品都是分析级的，不需要进一步提纯。

二、表征方法

用日本岛津3000分光光度计记录BBTD与全血的紫外-可见-近红外吸收光谱。用680 nm氙气灯在QuantaMasterTM40上记录了BBTD和荧光纳米颗粒的近红外发射光谱。1H NMR和13C NMR在Bruker AV-400谱仪上进行了表征。用Zeiss Ultra 55场发射扫描电子显微镜(FE-SEM)记录了制备的纳米颗粒的形貌。采用Nano-ZS90 Zeta Sizer对纳米颗粒的动态光散射(DLS)和Zeta电位进行了表征。单分散的纳米探针数据通过Flow NanoAnalyzer (NanoFCM Inc.)表征。在680nm LED灯的激发下，用CMOS相机采集侧向流动测试条的图像。所有实验条件均在室温下进行。

三、合成BBTD@PS

NIR-II AIE荧光团(BBTD)和单分散PS的制备方法均参照以往报道的方法。BBTD通过膨胀法加载于PS (BBTD@PS)中。一般方法是先用500 μL SDS水溶液稀释PS (250 μL, 40 mg/mL)的水悬液，再加入THF (200 μL)。紧接着，加入10 μL THF中的BBTD染料溶液(20 mg/mL)。搅拌数小时后，将含BBTD的膨胀珠快速离心分离，用水洗涤三次，然后放入2ml超纯水中保存。

四、 BBTD@PS偶联捕获抗体(BBTD@PS@Ab)

根据先前描述的方案，捕获抗体共价固定在BBTD@PS上，并进行了一些优化。将捕获抗体修饰到BBTD@PS表面的典型步骤如下：用1ml BBS缓冲液(0.01 M BBS, pH7.4)洗涤100 μL BBTD@PS悬液(约含2mg干PS)。将BBTD@PS置于含200 μg EDC和112 μg磺酰nhs的0.50 mL BBS缓冲液中，室温激活1 h。之后，获得的复合物被离心分离去除多余化学试剂，然后在0.50ml的包含0.20mg捕获抗体的BBS缓冲液中室温孵育3 h。然后，复合物在BSA溶液(10mg/ml)中室温封闭1 h。孵育后，BBTD@PS@Ab用1mlBBS缓冲液(0.1 M BBS, pH7.40)清洗，并在4度条件下存放在1ml BBS缓冲液(含1% BSA和0.05% proclin300)中。

五、侧向流动试验条的制作

侧向流动测试条由四部分组成：PVC基材、样品垫、NC膜和吸收垫。用喷雾器将BBTD@PS@Ab (16.70 mg/mL)以1.20 μL/ cm的速度滴在样品垫板上，然后在37度下过夜干燥。用喷雾装置以1 μL/cm的速度分别喷施检测抗体(2 mg/mL)和兔抗鼠IgG (1.80 mg/mL)，室温干燥过夜。最后，用切纸机将组装好的带材切成3.80毫米的单横向流带材，并放入塑料卡片中。

六、用预制的侧向流动测试条进行测定

用全血稀释抗原原液制备AFP全血标本(0、0.80、8、80、400、800、3200、5700 ng/mL)。将AFP加标10 μL的血液样品加入90 μL BBS缓冲液(0.10 M, pH7.40，含1% BSA, 0.25% Tween 20和0.25% B66)中，得到溶血样品。然后，将混合溶液加入到侧向流动测试带的孔中。反应10分钟后，荧光数据由NIR-II读取器记录。所有试验重复三次。

结果展示：

图1. (a) BBTD@PS的制备过程。(b) BBTD@PS和空PS的FE-SEM图像。(c) BBTD@PS和空PS的流体动力学尺寸。(d) Flow NanoAnalyzer测量的单个BBTD@PS的尺寸分布。

图2. (a) BBTD@PS和BBTD在680 nm氙气灯激发下的发射光谱。(b) BBTD@PS在1.6 W 680 nm激光激发下60分钟的光稳定性。(c) BBTD@PS连续监测120天的荧光强度。(d)BBTD@PS储存120天前后在水中的流体动力尺寸。(d) BBTD@PS和空PS的Zeta电位。

这里只展示部分结果，主要还是分享一下文章的实验方法是怎么做的。有兴趣的话可以自己找这篇文献具体看，或者私聊我要文献资料。

最后，有理解得不对的地方，欢迎专业人士指正，一起交流~

参考文献：

[1]Rui Chen, Xiaobo Zhou, Yong Wu, Qingyun Liu, Qian Liu, Jinhua Huang, Fuyou Li, NIR-II emissive lateral flow immunoassay for accurate determination of tumor marker in hemolysis,Sensors and Actuators B: Chemical,Volume 328,2021,129050