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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 干扰/敲除 » CRISPR-Cas9大肠杆菌基因敲除
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ljvienna

新虫 (初入文坛)

[交流] CRISPR-Cas9大肠杆菌基因敲除

从addgene购买了敲除质粒pCRISPR和pCas9，先将sgRNA连接到pCRISPR上，转化DH5α，验证成功后提取质粒。然后将pCas9导入大肠杆菌后，转化pCRISPR-sgRNA复苏后涂布双抗平板，菌落长很多，但验出来都是没有敲除的，怎么回事呢？是我忽略了什么重要细节吗？求大神指点！
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1楼2021-04-24 22:57:27
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

lzk234

铜虫 (小有名气)
★
ljvienna(金币+1): 谢谢参与
1、你的同源臂多长，同源臂的长度会影响敲除效率（我们实验室同源臂长度一般为1200bp，上下游各600bp）
2、N20的靶向效率，有的N20效率不行，所以可以考虑换N20
3、还有你的电转感受态效率，同源重组酶的诱导效果（建议阿拉伯糖现用现配），甘油用好一些的。
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8楼2021-04-28 10:21:26
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lzk234

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by HK驱魔者 at 2021-04-28 11:26:42
你好，我最近电转的时候总是出现arc请问你遇到过吗
...

用的什么牌子的电转仪，我用的Bio-Rad的电转仪，有时候也会出现错误，这时候有两种情况导致这种问题
1、你的电转杯裂了，也就是通常所说的击穿了
2、你的感受态体系里离子太多，导致电转失败
2.1、感受态离子太多就多用水洗两遍
2.2、质粒离子浓度太高，在乙醇洗的时候多洗一次，最后要用灭过菌的超纯水洗脱
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11楼2021-04-30 15:07:32
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lzk234

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by HK驱魔者 at 2021-04-28 11:26:42
你好，我最近电转的时候总是出现arc请问你遇到过吗
...

我扣扣：1424635314   你可以加我，希望天下少一个因为敲除做不出来的伤心人
赞一下(1人) 回复此楼
12楼2021-04-30 15:08:38
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HK驱魔者

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by lzk234 at 2021-04-30 15:07:32
用的什么牌子的电转仪，我用的Bio-Rad的电转仪，有时候也会出现错误，这时候有两种情况导致这种问题
1、你的电转杯裂了，也就是通常所说的击穿了
2、你的感受态体系里离子太多，导致电转失败
2.1、感受态离子太 ...

好的谢谢，我感觉是我的感受态没做好的原因，其实最近敲除也还可以，就是电转效率一直不高，涂板后只能张十几个菌，但是敲除效率还挺高的，有80%左右

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13楼2021-04-30 19:24:01
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)
★
ljvienna(金币+1): 谢谢参与
哥，可以送我敲除质粒pCRISPR和pCas9吗？
从addgene买太麻烦了，国内买的又不太放心。我有什么您需要，可以换，或者出钱购买。

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3楼2021-04-25 07:34:20
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ljvienna

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by snoopyzxx at 2021-04-25 07:34:20
哥，可以送我敲除质粒pCRISPR和pCas9吗？
从addgene买太麻烦了，国内买的又不太放心。我有什么您需要，可以换，或者出钱购买。

你们也在做这方面的吗？
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4楼2021-04-25 09:49:46
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匿名


★
ljvienna(金币+1): 谢谢参与
本帖仅楼主可见
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5楼2021-04-26 13:29:26
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lzk234

铜虫 (小有名气)
★ ★
ljvienna: 金币+2 2021-06-09 21:43:57
引用回帖:
8楼: Originally posted by lzk234 at 2021-04-28 03:21:26
1、你的同源臂多长，同源臂的长度会影响敲除效率（我们实验室同源臂长度一般为1200bp，上下游各600bp）
2、N20的靶向效率，有的N20效率不行，所以可以考虑换N20
3、还有你的电转感受态效率，同源重组酶的诱导效果 ...

我这里面提到的第一点最先考虑，然后依次往下考虑
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9楼2021-04-28 10:42:00
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HK驱魔者

铁虫 (正式写手)
★
ljvienna(金币+1): 谢谢参与
引用回帖:
8楼: Originally posted by lzk234 at 2021-04-28 10:21:26
1、你的同源臂多长，同源臂的长度会影响敲除效率（我们实验室同源臂长度一般为1200bp，上下游各600bp）
2、N20的靶向效率，有的N20效率不行，所以可以考虑换N20
3、还有你的电转感受态效率，同源重组酶的诱导效果 ...

你好，我最近电转的时候总是出现arc请问你遇到过吗

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10楼2021-04-28 18:26:42
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ljvienna

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by lzk234 at 2021-04-28 10:42:00
我这里面提到的第一点最先考虑，然后依次往下考虑...

感谢感谢！
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15楼2021-06-09 21:44:50
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tzynew2楼
2021-04-24 23:04   回复  
ljvienna(金币+1): 谢谢参与
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miaojiabing6楼
2021-04-26 16:26   回复  
ljvienna(金币+1): 谢谢参与
7
bjdxyxy7楼
2021-04-26 16:41   回复  
ljvienna(金币+1): 谢谢参与
。 发自小木虫Android客户端
psylhh14楼
2021-05-01 20:51   回复  
ljvienna(金币+1): 谢谢参与
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