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求助，蛋白质native-PAGE!!!
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有谁做过碱性蛋白的native-PAGE，电泳缓冲液是酸性的，我想做这个电泳但对缓冲液和胶的配制不太清楚？那位等帮我一下？谢了！！！ [ Last edited by koko_007 on 2009-8-10 at 22:29 ] |
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duanyongzhong
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2楼2009-08-16 21:41:25
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我最近也在对一个疑似碱性蛋白进行非变性凝胶电泳（Native-PAGE），在网上搜索到的分离碱性蛋白使用的低pH凝胶系统如下： “1. 分离胶：0.06M KOH，0.376M Ac，pH4.3（7.7% T，2.67% C）； 2. 堆积胶：0.06M KOH，0.063M Ac，pH6.8（3.125% T，25% C）； 3. 电泳缓冲液：0.14M 2-丙氨酸，0.35M Ac，pH4.5 将正负电极倒置，用甲基绿（0.002%）为示踪剂” （注：C是与T有关的交联百分浓度。） 昨天按照这个配方配制了分离胶，结果在室温下（估计也就十度）过夜凝结，而且顶部凝结不完全、凸凹不平。今天我决定加倍APS和TEMED的使用量，再试一次看。 |
3楼2009-12-25 15:56:13
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再次配制，我加倍了APS和TEMED的用量，结果凝结得很好。 电泳时，将电极反接。从表象上看，甲基绿向凝胶中（负极方向）跑；然而我试验点入的一个蛋白质预染Marker无一条带跑进了凝胶，全部朝反方向（正极方向）的点样孔外逸散。（注：之前在碱性缓冲条件下进行非变性胶电泳时，这个共有6条带的预染Marker中有4条带进入了凝胶。因此我曾据此以为另2条是碱性蛋白，会在这次的酸性缓冲条件下进入凝胶。） 最后的结果是，我的疑似碱性蛋白并没有出现在凝胶里。而且，大肠杆菌的总蛋白对照样，也没有任何一条可见条带进入了凝胶。（注：之前在碱性缓冲条件下电泳时，总蛋白有不少条带出现在凝胶内，但条带量远少于SDS-PAGE的总蛋白条带量。） [ Last edited by 叔扬 on 2009-12-29 at 10:20 ] |
4楼2009-12-29 10:13:50
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