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糊涂仙8889木虫 (小有名气)
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geng fishing 技术
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GeneFishing技术用来检测不同样品间的表达差异。该技术着眼于解决目前用来检测基因表达差异的方法所面临的问题，如芯片技术和差异显示技术。该技术的实验包括以下三个步骤，反转录PCR (RT) 和两步法PCR (GeneFishing PCR)。 第一步： 用dT-ACP1引物合成cDNAs的第一链。dT-ACP1引物的3′端与mRNA的多聚A互补。这样第一链cDNA包含了dT-ACP1引物5´端的通用序列。 第二步： 把第一步得到的第一链cDNA稀释后和随机ACP及dT-ACP2一起加到PCR管。随机ACP引物的3′端序列能有效的结合到第一链cDNA的某一部位。在第一步PCR时，通过控制条件只能使随机ACP的3′端特异的结合到第一链cDNA的特定位置，而阻止dT-ACP2的3′端退火结合到第一链cDNA。通过第一步PCR合成第二链cDNA，其3′端包含了dT-ACP1通用序列的互补序列，而其5′端包含了随机ACP的通用序列。 第三步： 来自第二步的PCR管的混合物在更严格条件下进行第二步PCR，这时使dT-ACP2和随机ACP能各自退火结合到第二步得到双链cDNA的3′端和5′端。既然第二链cDNA的3′端序列与随机ACP引物的通用序列互补，而其5′端与dT-ACP2的通用序列互补，这样保证了只扩增目标产物。 该技术特点如下 (1) 无假阳性。GeneFishing技术鉴别的差异表达基因均可通过NorthernBlot分析或RT-PCR证实！现有的DEG检测方法，例如生物芯片和差异显示技术的主要瓶颈就是假阳性的存在。无假阳性可以使研究者能快速辨别可信的差异表达基因。 (2)无需PAGE（聚丙烯酰胺凝胶），琼脂凝胶法即足够。退火控制引物(ACP)极大地提高了PCR扩增的特异度和灵敏度，从而产生特异PCR产物。而且，GeneFishing技术只需要少量的起始物质。PCR产物可以在标准的溴化乙啶染色的琼脂凝胶中被检测，因而省去了使用PAGE（聚丙烯酰胺凝胶）的繁琐处理步骤。使用GeneFishing技术在琼脂凝胶中产生的条带具有足够浓度，可以被Northern Blot方法检测。 (3)无需昂贵的检测方法。放射性/荧光检测方法由于其成本和危险性而不能广泛应用。昂贵的检测方法是现今差别表达基因检测的另一缺点。因此，可以使用标准溴化乙啶染色的琼脂凝胶来进行检测是GeneFishing技术的一个主要优势。 (4)重复性保证。GeneFishing技术的所需反应试剂均由试剂盒提供。这样防止了由于使用旧的，不匹配的试剂而带来的变化，确保了可靠的重复性。 (5)无需特殊技术。GeneFishing 技术是一种以PCR技术为基础的创新方法，简单易用 (6)快速经济。GeneFishing技术使得研究者可以在５小时内确认有效的差异表达基因， 不必因为假阳性而浪费时间。相比之下，所有其他DEG筛选方法都需要大量的后续工作和时间来鉴别有效的差异表达基因。 (7) 大范围的PCR产物。每一个GeneFishing PCR反应产生从150bp至2kb长度范围的PCR产物，这不仅提高了鉴别差异表达基因的机会，还为预测基因功能提供了更多的有效序列信息。 |
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