| 查看: 870 | 回复: 1 | |||
| 当前主题已经存档。 | |||
[交流]
毕赤酵母表达实验手册
|
|||
|
毕赤酵母表达实验手册 一．毕赤酵母表达常用溶液及缓冲液的配制1．1 各种母液的配制10*YNB （含有硫酸铵、无氨基酸的13.4%酵母基础氮源培养基） 4℃保存。34g酵母基础氮源培养基（无硫酸铵）+100g硫酸铵，溶于1000ml水中，过滤除菌。500*B （0.02%生物素 Biotin） 4℃保存 保存期为1年。20mg的生物素溶于100ml水中，过滤除菌。100*H （0.4%Histidine 组氨酸） 4℃保存 保存期为1年。400mg的L-组氨酸溶于100ml水中，（加热至50℃以促进溶解），过滤除菌。10*D （20%Dextrose 葡萄糖） 保存期为1年。200g葡萄糖溶于1000ml水中，灭菌15min或过滤除菌。10*M （5%Methanol 甲醇） 保存期为2个月。将5ml的甲醇与95ml水混匀，过滤除菌。10*GY （10%Glycerol 甘油） 保存期为1年以上。将100ml甘油和900ml水混匀后，高压灭菌或过滤除菌。100*AA （0.5% of each Amino Acid，各种氨基酸） 4℃保存 保存期为1年。分别将500mg的L-谷氨酸、L-蛋氨酸、L-赖氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸溶于100ml水中，过滤除菌。1M 磷酸钾溶液（potassium phosphate buffer，pH6.0），将1mol/L的K2HPO4溶液132ml与1mol/L的KH2PO4溶液868ml混匀，其pH为6.0，如需调节pH，则使用磷酸和氢氧化钾调节pH。1.2 常用溶液及缓冲夜1.2.1 碱裂解法抽提质粒DNA所用溶液： 溶液Ⅰ：50mmol / L glucose，100mmol / L EDTA，25mmol / L Tris－HCI (pH 8.0)溶液Ⅱ：0.2mol／L NaOH，1％ SDS（临用时配制）溶液Ⅲ：29.44g KAc，11.5ml Acetic acid，加ddH2O至100 ml。4℃保存。1.2.2 10% 甘油 （Glycerol）：将100ml甘油和900ml水混匀后，高压灭菌或过滤除菌。保存期为1年以上。1.2.3 Rnase-H2O：1ul Rnase 加入1ml 灭菌 dd H2O。4℃保存。1.2.4 TE缓冲液：10mmol / Tris-CI（pH 8．0）， lmmol / L EDTA（pH 8.0）1.2.5 STE缓冲液：0.1mol / L, 10mmol / L Tris-HCl (pH 8.0), 1mmol / L EDTA (pH 8.0)1.2.6 SCE缓冲液：1mol / L Sorbitol (山梨醇), 10mmol / L 柠檬酸钠 ， 10mmol / L EDTA1.2.7 1M potassium phosphate buffer （pH 6.0）： 132 ml 1M K2HPO4 868 ml 1M KH2PO41.2.8 50X TAE 琼脂糖凝胶电泳缓冲液，pH 8.0（1L）： 242 g Tris 57.1 ml Acetic Acid 37.2 g EDTA二．毕赤酵母表达的培养基配制［5］2.1 LB（Luria－Bertani）培养基： Trypton l％ Yeast Extract 0.5％ NaCl l％ PH 7.0制作平板时加入 2％琼脂粉。121℃高压灭菌 20min。可于室温保存。用于培养pPICZαA原核宿主菌TOP10F’时可加入Zeocin 25ug / ml。2.2 LLB（Low Salt LB）培养基： Trypton l％ Yeast Extract 0.5％ NaCl 0.5％ PH 7.0制作平板时加入 2％琼脂粉。121℃高压灭菌 20min。可于室温保存数月。用于培养pPICZαA原核宿主菌TOP10F’时，加入Zeocin 25ug / ml，可以4℃条件下保存1～2周。2.3 YPD （又称YEPD）Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，酵母浸出粉/胰蛋白胨/右旋葡萄糖培养基） Trypton 2%dextrose (glucose) 2%+agar 2%+Zeocin 100 µg/ml液体YPD培养基可常温保存；琼脂YPD平板在4℃可保存几个月。加入Zeocin 100ug / ml，成为YPDZ培养基，可以4℃条件下保存1～2周。2.4 YPDS + Zeocin 培养基（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium）：yeast extract 1%peptone 2%dextrose (glucose) 2%sorbitol 1 M+agar 2%+ Zeocin 100 µg/ml不管是液体YPDS培养基，还是YPDS + Zeocin 培养基，都必须存放4℃条件下，有效期1～2周。2.5 MGY Minimal Glycerol Medium （最小甘油培养基）（34%YNB；1%甘油；4*10-5%生物素）。将800ml灭菌水、100ml的10*YNB母液、2ml的500*B母液和100ml的10*GY母液混匀即可，4℃保存，保存期为2个月。2.6 MGYHMinimal Glycerol Medium + Histidine （最小甘油培养基 + 0.004%组氨酸）在1000ml的MGY培养基中加入10ml的100*H母液混匀，4℃保存，保存期为2个月。2.7 RDRegeneration Dextrose Medium （葡萄糖再生培养基）（含有：1mol/L的山梨醇；2%葡萄糖；1.34%YNB；4*10-5%生物素；0.005%氨基酸）1. 将186g的山梨醇定容至700ml，高压灭菌；2. 冷却后于45℃水浴；3. 将100ml的10*D、100ml的10*YNB；2ml的500*B；10ml的100*AA等母液和88ml无菌水混匀，预热至45℃后，与步骤2的山梨醇溶液混合。4℃保存。2.8 RDHRegeneration Dextrose Medium + Histidine （葡萄糖再生培养基 + 0.004%组氨酸）在RD培养基配制的第三步中，在加入10ml的100*H母液，同时无菌水的体积减少至78ml即可，其余配制方法与RD相同。4℃保存。2.9 RD及RDH平板的制备1. 将186g的山梨醇和15~20g琼脂粉定容至700ml，高压灭菌；冷却后于60℃水浴；2. 参照RD/RDH液体培养基配制的步骤4，将100ml的10*D、100ml的10*YNB；2ml的500*B；10ml的100*AA等母液、（10ml的100*H母液）和88（78）ml无菌水混匀，预热至45℃后，与步骤1的山梨醇/琼脂液混匀；3. 迅速制备平板。4℃可保存数月。2.10 RD及RDH 的TOP 琼脂的制备（常用于酵母菌的包被）1.将186g的山梨醇和7.5~10g琼脂粉定容至700ml，高压灭菌；冷却后于60℃水浴；2.参照RD/RDH液体培养基配制的步骤4，将100ml的10*D、100ml的10*YNB；2ml的500*B；10ml的100*AA等母液、（10ml的100*H母液）和88（78）ml无菌水混匀，预热至45℃后，与步骤1的山梨醇/琼脂液混匀；3.将该TOP琼脂置于45℃水浴冷却、保温，备用。2.11 MD与MDHMinimal Dextrose Medium +（Histidine） 最小葡萄糖培养基 +（ 0.004 %组氨酸）（含有：1.34%YNB；；4*10-5% 生物素；2%葡萄糖）1. 100ml的10*YNB；2ml的500*B和100ml10*D母液，用800ml的无菌水定容至1000ml即可；2. 如配制MDH，可在上述的MD中加入10ml的100*H即可；3. 如配制平板，可无菌水的灭菌前，加入15~20g的琼脂。4℃可保存数月。2.12 SOC培养基： Trypton l％ Yeast Extract 0.5％ NaCl 0.05％ Glucose (1mol / L) 2%121℃高压灭菌 20min，冷却后，4℃保存三．主要试验环节的操作3.1 酵母菌株的分离纯化 接种GS115于5ml YPD液体培养基，30℃，200rpm振荡过夜，涂布 YPD平板，30℃培养48 小时，用 YNB基本培养基和含His的补充培养基作点种分离纯化，挑选在补充培养基生上生长而在基本培养基上不生长的单菌落划YPD平板，4℃保存。3.2 pPICZαA原核宿主菌TOP10F’的活化培养TOP10F’做为菌种保存在－70 ℃条件下，在进行扩大培养抽提质粒之前，先要进行活化培养。接种TOP10F’于5ml LLB（加入25ug / ml Zeocin）中，37℃，200 rpm ，培养16～18小时。3.3毕赤酵母表达的试验方法3.3.1线状质粒DNA的脱磷酸化处理 为了防止载体质粒DNA的自身环化，用小牛肠碱性磷酸酶（CIP）处理酶切后的质粒DNA，具体操作如下：⑴ 建立反应体系：线性化的质粒 35ul 10x CIP buffer 4ul CIP 1ul ddH2O 5ul ——————————————————————————total 45ul⑵ 在PCR仪上控制反应温度（加石蜡油封闭），37℃，15 min ；50℃，15 min；56℃，30 min（灭活）。⑶ 在56℃未开始前停止，加入proteinse K ，用于灭活CIP，加入试剂如下：反应物 45ul 10x 5％ SDS 7ul 10x EDTA （pH 8.0） 7ulproteinse K 5ul ddH2O 6ul ——————————————————— total 70ul⑷ 纯化使用QIAquick spin kit ，按照2.2.3.3步骤进行，20 ul 灭菌ddH2O洗脱纯化产物。进行1％琼脂糖凝胶电泳，120 V， 观察纯化结果，并大约估计DNA浓度。3.3.2 E.coli TOP10F’ 感受态细胞的制备及转化⑴ 取10 ul TOP10F’ 菌液，接种于 200ml LB液体培养基中活化培养，37℃ ，200 rpm，16～18小时。取100 ul菌液接种于 200 ml 液体LB培养基中。⑵ 37℃ ，200 rpm，培养16～18小时。⑶ 灭菌500 ml 离心管，4℃，4000 rpm，20 min 。得菌体沉淀。弃上清，菌体用10％甘油重悬并洗涤。重复洗涤3次。⑷ 第三次离心后，弃绝大部分上清，留下约1ml 液体用于重悬菌体。⑸ 从制得得感受态细胞中，取200 ul于灭菌EP管中，加入连接反应产物 5ul ，混匀，不要产生气泡，在冰上放置 5 min。⑹ 将混匀后得200ul菌液移入电击杯中。⑺ 使用电击穿孔仪进行转化，设置为 电压 2500 V，时间 5 ms。⑻ 电击后，往电击杯中加入 800ul SOC培养基，冲洗出菌体，转移至灭菌1.5 ml EP管中。37℃，150 rpm ，轻摇45～60 min。⑼ 取全部均匀涂布于含 Zeocin 25 ug/ml 的LLB－Zeocin平板上，正放，待涂布液不在流动，37℃ 培养12～16小时。*注：设空载体做对照。3.4 毕赤酵母电转化方法3.4.1 菌体的准备：1. 挑取酵母单菌落，接种至含有5ml YPD培养基的50ml三角瓶中，30℃、250~300r/min培养过夜；2. 取100~500µl的培养物接种至含有500ml新鲜培养基的2L三角摇瓶中，28~30℃、250~300r/min培养过夜，至OD600达到1.3~1.5；3. 将细胞培养物于4℃，1500g离心5min，用500ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；4. 按步骤3离心，用250ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；5. 按步骤3离心，用20ml的冰预冷的1mol的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬；6. 按步骤3离心，用1ml的冰预冷的1mol的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为1.5ml；7. 备注：可将其分装为80µl一份的包装冷冻起来，但会影响其转化效率（2周之内）。3.4.2 电击转化：8. 将5~20µg的线性化DNA溶解在5~10µl TE溶液中，与80µl的上述步骤6所得的菌体混匀，转至0.2cm冰预冷的电转化杯中；9. 将电转化杯冰浴5min；10. 根据电转化仪提供的资料，参考其他文献及多次摸索，确定合适的电压、电流、电容等参数，按优化的参数，进行电击；11. 电击完毕后，加入1ml冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀，转至1.5ml的EP管中；12. 将菌体悬液涂布于MD或RDB平板上，每200~600µl涂布一块平板；13. 将平板置于30℃培养，直至单个菌落出现。推荐：电压1.5kV；电容25µF；电阻200Ω。电击时间为4～10msec。 3.5 Pichia酵母表达直接PCR鉴定重组子的方法 |
回复此楼» 猜你喜欢
澳大利亚 Murdoch University 全奖博士招生（3个名额）地质化工冶金领域
已经有24人回复
-
阿姨
已经有4人回复
-
一作与独作在应聘高校教师时区别大吗
已经有4人回复
-
咱们一起用铁证分析2026国家社科基金中标与否
已经有9人回复
-
欢迎发来filecode的Mz6后的代码验证其规律
已经有18人回复
-
静等基金结果
已经有21人回复
-
FileCode能看出啥？
已经有28人回复
-
有时候，自然基金真的不能太认真 （我的申报经验）
已经有6人回复
-
filecode
已经有16人回复
-
重要来源：本周末出结果
已经有10人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
陶古斯
木虫 (著名写手)
- 应助: 5 (幼儿园)
- 金币: 2501.6
- 散金: 903
- 红花: 3
- 帖子: 1293
- 在线: 100.5小时
- 虫号: 681077
- 注册: 2008-12-24
- 性别: GG
- 专业: 微生物生理与生物化学
2楼2009-12-05 01:15:30
