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Western印迹法步步看
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这种技术是把电泳分离的组分从凝胶转移到一种固相支持体，并以针对特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针检测之。Western使用的探针是抗体，它与附着于固相支持体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。这种技术的作用是对非放射性标记蛋白组成的复杂混合物中的某些特异蛋白进行鉴别和鉴定。 仪器： 高压锅、玻璃匀浆器、高速离心机、分光光度仪、—20℃ 低温冰箱、垂直板电泳转移装置、恒温水浴摇床、多用脱色摇床。 试剂： 单去污剂裂解液、0.01mol/L PBS (pH7.3)、10％分离胶、4％浓缩校、G250考马斯亮蓝溶液、0.15mol/L NaCl 溶液、2X（5X）SDS上样缓冲液、电泳缓冲液、转移缓冲液、10X丽春红染液、封闭液、TBST、TBS、洗脱抗体缓冲液、显影液、定影液、抗体、化学发光试剂。 杂品与耗材： 各种规格的吸头、离心管和加样器；各种规格的烧杯、量筒和平皿等玻璃器材；硝酸纤维素膜，乳胶手套，保鲜膜，搪瓷盘（>20×20cm），X-光片夹，X-光片，玻棒长短各一根，计时器，吸水纸， 试剂配制： （一）母液 1.0mol/L Tris ·HCl Tris (MW121.14) 30.29g 蒸馏水 200ml 溶解后，用浓盐酸调pH至所需点（见下所示），最后用蒸馏水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。 PH HCl 7.4 约17ml 7.5 约16m 7.6 约15ml 8.0 约10ml 1.74mg/ml (10mmol/L)PMSF PMSF 0.174g 异丙醇 100ml 溶解后，分装于1.5ml 离心管中，－20℃ 保存。 0.2mol/L NaH2PO4 NaH2PO4 （MW119.98） 12g 蒸馏水至 500ml 溶解后，高压灭菌，室温保存。 0.2mol/LNa2HPO4 Na2HPO4 ·12H2O（MW 358.14） 71.6g 蒸馏水至 1000ml 溶解后，高压灭菌，室温保存。 10 ％SDS SDS 10g 蒸馏水至 100ml 50℃ 水浴下溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。 10 ％过硫酸胺（AP） 过硫酸胺 0.1g 超纯水 1.0ml 溶解后，4℃ 保存，保存时间为1周。 1.5mol/L Tris ·HCl（pH8.8） Tris (MW121.14) 45.43g 超纯水 200ml 溶解后，用浓盐酸调pH至8.8，最后用超纯水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。 0.5mol/L Tris ·HCl（pH6.8） Tris (MW121.14) 15.14g 超纯水 200ml 溶解后，用浓盐酸调pH至6.8，最后用超纯水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。 40 ％Acr/Bic（37.5：1） 丙稀酰胺（Acr） 37.5g 甲叉双丙稀酰胺（Bic） 1g 超纯水至 100ml 37℃ 下溶解后，4℃ 保存。使用时恢复至室温且无沉淀。 20 ％Tween20 Tween20 20ml 蒸馏水至 100ml 混匀后4℃ 保存。 （二）使用液 单去污剂裂解液 （ 50mmol/L Tris·HCl pH8.0，150mmol/L NaCl，1％TritonX－100，100 m g/ml PMSF ）： 1mol/L Tris·HCl（pH8.0） 2.5ml NaCl 0.438g TritonX－100 0.5ml 蒸馏水至 50ml 混匀后， 4℃ 保存。使用时，加入PMSF至终浓度为100 m g/ml（0.87ml裂解液加入1.74mg/ml PMSF50μl）。 0.01mol/L PBS （ pH 7.2-7.4） 0.2 mol/L NaH2PO4 19ml 0.2 mol/L Na2HPO4 81ml NaCl 17g 蒸馏水至 2000ml G250 考马斯亮蓝溶液（测蛋白含量专用） 考马斯亮蓝G250： 100mg 95％乙醇： 50ml 磷酸： 100ml 蒸馏水至 1000ml 配制时，先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料，再加入磷酸和水，混匀后，用滤纸过滤，4℃ 保存。 0.15 mol/L NaCl NaCl（MW58.44） 0.877g 蒸馏水至 100 ml 高温灭菌后，室温保存。 100mg/ml 牛血清白蛋白（BSA） BSA 0.1g 0.15 mol/L NaCl 1ml 溶解后，－20℃ 保存。制作蛋白标准曲线时，用0.15 mol/L NaCl进行100倍稀释成1mg/ml，－20℃ 保存。 10 ％分离胶和4 ％浓缩校 10％分离胶（两块胶，10ml） 4％浓缩胶（两块胶，5ml） 超纯水 4.85ml 3.16ml 40％Acr/Bic（37.5：1） 2.5ml 0.5ml 1.5 mol/L Tris·HCl（pH8.8） 2.5ml － 0.5 mol/L Tris·HCl（pH6.8） － 1.26ml 10％SDS 100 m l 50 m l 10%AP（过硫酸胺） 50 m l 25 m l TEMED 5 m l 5 m l 加TEMED后，立即混匀即可灌胶。 还原型5XSDS上样缓冲液 （0.25mol/L Tris·HCl pH6.8，0.5mol/L二硫叔糖醇，10％ SDS，0.5％溴酚蓝，50％甘油） 0.5 mol/L Tris·HCl（pH6.8） 2.5ml 二硫叔糖醇（DTT，MW154.5） 0.39g SDS 0.5g 溴酚蓝 0.025 甘油 2.5ml 混匀后，分装于1.5ml 离心管中，4℃ 保存。 电泳液缓冲液 （25mmol/L Tris，0.25mol/L甘氨酸，0.1％ SDS） Tris（MW121.14） 3.03g 甘氨酸（MW75.07） 18.77g SDS 1g 蒸馏水至 1000ml 溶解后室温保存，次溶液可重复使用3～5次。 转移缓冲液 （48mmol/L Tris，39mmol/L甘氨酸，0.037％ SDS，20％甲醇 ） 甘氨酸（MW75.07） 2.9g Tris（MW121.14） 5.8g SDS 0.37g 甲醇 200ml 蒸馏水至 1000ml 溶解后室温保存，次溶液可重复使用3～5次。 10X 丽春红染液 丽春红S 2g 三氯乙酸 30g 磺基水杨酸 30g 蒸馏水至 100ml 使用时将其稀释10倍。 Sample TextTBS 缓冲液 （100mmol/ L Tris·HCl pH7.5,150mmol/L NaCl） 1 mol/ LTris·HCl（pH7.5） 10ml NaCl 8.8g 蒸馏水至 1000ml TBST 缓冲液 （含0.05％Tween20的TBS缓冲液） 20％Tween20 1.65ml TBS 700ml 混匀后即可使用，最好现用现配。 1* TBST 1L Tris base 2.422g (MW121.4) Nacl 8.775g Tween20 0.5ml 封闭液 （含5％脱脂奶粉的TBST缓冲液） 脱脂奶粉（国产，安怡牌） 5g TBST 100ml 溶解后4℃ 保存。使用时，恢复室温，用量以盖过膜面即可，一次性使用。 洗脱抗体缓冲液 （100mmol/L 2-Mercaptoethanol，2％SDS，62.5m mol/L Tris·HCl pH6.8） 14.4 mol/L 2- Mercaptoethanol(β-巯基乙醇) 700 m l（通风厨里加） SDS 2g 0.5mol/L Tris·HCl（pH6.8） 12.5ml 超纯水至 100ml 配制时，在通风厨内进行。4℃ 保存。可重复使用1次。 显影液（5X） 自来水（加热至50℃ ） 375ml （以下药品加到温水中） 米吐尔 1.55g 亚硫酸钠（无水） 22.5g 碳酸钠（无水） 33.75g 溴化钾 20.95g 补水至 500ml 配制时，上述药品应逐一加入，待一种试剂溶解后，再加入后一种试剂。4℃ 保存。使用时用自来水稀释至1倍。 定影液 自来水（50～60℃） 700ml （以下药品按顺序加入前者溶解后再加后者） 硫代硫酸钠 240g 亚硫酸钠（无水） 15g 冰乙酸 12.6ml 硼酸 7.5g 钾明矾 15g（水温冷至30℃ 以下时再加入） 加水定容至1000ml，室温保存 抗体 用TBST稀释至一定浓度使用，每张膜需0.5ml 化学发光试剂 购自北京中山公司，为Santa Cruz产品，分A和B两种试剂。 |
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2楼2009-07-30 00:11:40
陶古斯
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