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关于包涵体蛋白纯化时的包涵体重悬问题已有1人参与
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| 我的纯化流程基本上是细胞破碎之后离心，用8M尿素重悬沉淀以溶解包涵体中的目标蛋白。我的问题是重悬这一步比较困难。加入8M尿素之后沉淀像胶泥一样，难以彻底打碎。可能也是这个原因，最后用尿素处理完的沉淀里依然有不少目标蛋白，影响产率。对付这种粘稠的沉淀有没有什么好的重悬手段？ |
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snoopyzxx
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ValYu(金币+1): 谢谢参与
ValYu: 金币+8, 很有价值的建议！ 2020-12-31 12:46:22
fuyuandj86: BioEPI+1 2020-12-31 14:29:11
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fuyuandj86: BioEPI+1 2020-12-31 14:29:11
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楼主不要直接用包涵体溶解液去溶解包涵体。 按下面的步骤处理： 包涵体沉淀先用少量PBS或其他不含变性剂的缓冲重悬（玻璃棒稍微搅散），体积不要太多，只要能进行超声就可以。 然后将该悬浊液进行几轮冰浴超声，直至该悬浊液彻底分散（分散的意思不是说溶解），没有大块的沉淀为止。用那种有分散功能的均质仪也可以。 然后将该液体缓慢（逐滴）加到包涵体溶解液中，磁力搅拌器边加边搅拌。 有的包涵体非常难溶解，可以适当补加2-3M盐酸胍来助溶。 |
2楼2020-12-30 12:57:16
zsygxh
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ValYu: 金币+5, 谢谢意见！ 2020-12-31 12:51:20
fuyuandj86: 金币+20 2020-12-31 14:30:36
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fuyuandj86: 金币+20 2020-12-31 14:30:36
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按理来说，8M Urea竞争氢键能将结构舒展开，疏水作用也因水分子氢键结构的破坏而大大减弱，所以溶解效果差的原因可以往这几个方面考虑： 1. 分子间形成了大量的二硫键交联，而还原剂的量不够。看一下序列，是不是有比较多的Cys，如果是，增加还原剂的量，比如10mM或20mM DTT，顺便可以加几个mM的EDTA，可以螯合金属离子，避免可能存在的分子间的配位键形成 2. 分子间的静电作用力比较强，形成了大聚集体。看一下序列是否有大量带电荷的残基，如果是，加入盐以减弱电荷吸引力，或用盐酸胍溶解 3. 非极性氨基酸过多，非极性残基因范德华作用力聚集形成紧密实体难以溶解 另外，溶解倍数大一点，时间长一点，比如过夜。如果用盐酸胍溶的话，可以尝试提高溶解温度或在盐酸胍中超声（但在尿素中不要这么干，因为尿素存在降解问题，产生的异氰酸会对NH2-和部分侧链产生修饰） 还有最好先洗一下包涵体，因为破菌沉淀的组分很杂，有很多非极性或带较强负电的杂质能与蛋白聚集在一起导致难以溶解。 |
4楼2020-12-30 16:59:27
7楼2020-12-31 12:43:05
snoopyzxx
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ValYu8楼2020-12-31 15:03:05
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3楼2020-12-30 14:08:48
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5楼2020-12-30 17:46:05
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6楼2020-12-31 08:59:14
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9楼2021-01-02 16:38:16
10楼2021-01-05 14:43:28
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