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流式细胞周期与细胞凋亡实验相关内容总结
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第一部分 细胞流式检测简介 1. 细胞流式检测 就是对在高速流动的鞘液包裹下的细胞、粒子进行分析和分选的技术，这种细胞或粒子是经过特异荧光标记的。其特点是测量速度快，每秒钟能测数千个乃至上万个细胞，且可进行多参数测量，另一特点是在分析的同时可把具有指定特征的细胞分离出来，这就是分选技术。 2. 工作原理 流式细胞仪利用散射和发射荧光组合来产生数据。通过流式细胞仪运行样本(通常是细胞悬液)时，鞘液用于以流体动力学聚焦方式迫使细胞悬液通过小喷嘴，并以单细胞方式通过激光。前向和侧向散射光(分别为 FS 和 SS)以及染色细胞发射的荧光通过检测器收集。FS 与细胞大小有关，SS 与细胞的粒度成正比，您可以根据细胞群的大小和粒度来区分细胞群。 3. 重要参数 前向角散射（FSC）：前向角散射光的强度与细胞的大小有关，也就是说，同一个细胞群体，FSC强的，其细胞大一些，而FSC弱的，其细胞小一些。 侧向角散射（SSC）：侧向角散射又称90°散射或大角散射。侧向角散射光对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，对胞内较大的颗粒也会有反应。所以，侧向角散射光的强弱可反应细胞内精细结构和颗粒的性质。 荧光信号（FL）：是细胞或细胞上的荧光染料被激光激发后发射出的荧光，不同的荧光染料其发射波长不同。通过荧光强度可将同一个细胞群体中的有荧光标记的细胞与无荧光标记的细胞区分开来，也就是我们通常所说的阳性细胞，也可以将阳性细胞中的高FL的细胞与低FL的细胞区分开来，也就是可以把强阳性细胞和弱阳性细胞区分开来。一般的流式细胞仪只装有一个激光光源（488nm），可测出三个FL，即FL1、FL2、FLT3。 FL2-W指检测荧光的脉冲宽度，区分单个细胞和双联体细胞 FL2-H指脉冲高度，细胞单位面积上的荧光浓度 FL2-A指脉冲面积，即细胞荧光总和 第二部分 细胞周期与细胞凋亡 流式检测细胞周期 细胞周期（细胞分裂周期）：即单个细胞的生长过程，指母细胞分裂后形成的细胞到下一次再分裂成两个子细胞之间的时期。细胞是借助分裂来进行增殖的，通过细胞分裂即可将复制的遗传物质平均地分配到两个子细胞中。 大部分细胞群体都由分裂和不分裂两部细胞混合组成。而不分裂细胞又可分为两类：即保持再进入细胞周期能力的G0期细胞（或叫静置细胞或休止细胞）及不分裂最终注定要死亡的终止分化细胞（或称之终端分化细胞），他们不能再进入周期。进入周期内的细胞可以分为两个期：间期（G1+S+G2），M期（有丝分裂期），整个细胞周期组成是G0+G1+S+G2+M。 A. 原理 碘化丙啶（PI）单染法（DNA周期分析）：流式细胞仪检测细胞周期的原理是根据细胞在不同的细胞周期时相中DNA含量存在差异的特点，应用DNA荧光染料染色，检测细胞内DNA荧光强度变化，判断细胞所处的细胞周期。常用碘化丙锭（P1）作为染料。Pl为核酸嵌入型染料，可以插人双股螺旋多聚核苷酸结构中，导致DNA和RNA着色。 B. 操作步骤 （1）取培养细胞1瓶，用胰蛋白酶消化，用PBS制备成细胞悬液。 （2）1000 r离心10min，弃上清液。加入70%乙醇固定液重悬细胞，固定30min。 （3）1000 r离心10min后，用PBS离心洗涤2次。 （4）离心后，用RNA酶消化细胞，室温30min。 （5）重复步骤（3）。 （6）用PI染料处理细胞20min。 （7）同步骤（3）用PBS洗涤细胞。 （8）在流式细胞仪488nm激发波长下测定。 观察并记录处于各细胞周期G1/G0、S以及G2/M期的细胞百分数。 C. 注意事项 细胞收集后及时固定，防止自溶或DNA降解。 要用对细胞穿透性强的固定剂，一般选择70%乙醇。 PI为致癌物质，避免用手直接接触。 细胞数目应该达到2×104个，细胞数目过少影响实验结果的准确性。 在制备时，离心次数不宜过多，防止细胞丢失。 D. 结果分析 常用的流式细胞术分析细胞周期的方法是依据细胞DNA含量（横坐标）来分析的： G1期：DNA复制还没开始，也是DNA含量最少的，即流式检测结果图的第一个峰； S期：DNA开始复制，到完成复制，是一个一倍DNA到二倍DNA的过程，在流式结果图中显示期跨度特别大（第二个不高但很宽的峰）； G2期：DNA复制完成至分裂的一段时间，此时细胞内含二倍DNA，在流式结果图中的第三个峰； M期：细胞分裂过程，此时细胞内也是二倍DNA，用DNA含量的方法是无法与G2期分开，所以有第三峰明显升高时报告：G2/M期阻滞。 流式检测细胞周期（双染法） 细胞凋亡：细胞膜组分磷脂酰丝氨酸（ PS）在正常情况下位于细胞膜内侧，当细胞坏死或凋亡时，则迁移至细胞膜外侧。磷脂结合蛋白V（Annexin V）是一种钙依赖性的磷脂结合蛋白， 它与PS具有高度的结合力。荧光素 FITC 标记的Annexin V可以作为探针检测暴露在细胞膜外侧的磷脂酰丝氨酸，指示坏死或凋亡的细胞。FITC-AnnexinV结合到细胞后，在蓝色光的激发下，发出绿色荧光。 A. 原理 碘化丙啶（Propidiumiodide，PI）是一种核酸染料，它不能穿透完整细胞膜，但对凋亡晚期细胞和死细胞的破损细胞膜能够穿透，并使细胞核红染， 而细胞膜保持完好的早期凋亡细胞则不会有红色荧光产生。 联合应用AnnexinV-FITC和PI对培养体系中的细胞进行染色，AnnexinV(-)/PI(-) 代表健康活细胞， AnnexinV(+)/PI(-)代表早期凋亡细胞， AnnexinV(+)/PI(+)代表晚期凋亡细胞和坏死细胞，后两者之和即为受损细胞总量。 AnnexinV(-)/PI(-) AnnexinV(+)/PI(-) AnnexinV(+)/PI(+) 代表健康活细胞 代表早期凋亡细胞 代表晚期凋亡细胞和坏死细胞 B. 操作步骤 （1）培养细胞，诱导凋亡。 （2）收集细胞悬浮细胞直接收集。贴壁细胞先用滴管轻轻吹打，收集已脱落的细胞至离心管。加入适量的胰酶消化未脱壁细胞并收集至上述离心管。1000r/min离心5min，弃上清液。 （3）冷PBS洗细胞2次。 （4）400目的筛网过滤1次。 （5）1×结合缓冲液悬浮细胞，并调整细胞数至1×106个/ml。 （6）取100μl细胞悬液至一个5ml玻璃管。 （7）加入5μ1膜联蛋白V-FITC和10μl PI[对照1：省略步骤（4）；对照2：只加膜联蛋白V-FITC；对照3：只加Pl]。 （8）轻轻混匀，室温下避光孵育15min。 （9）加入400μ1 1×结合缓冲液，即刻用流式细胞仪进行分析（亦可用荧光显微镜观察）。 C. 注意事项 操作中动作轻柔，低速离心，勿用力吹打细胞，尽量冰上操作。 与荧光染料反应完尽快检测，1h后荧光衰减。 AnnexinV-FITC和PI是光敏物质，操作时避光。 PI能透皮吸收，勿直接接触。 D. 结果分析 Q1：(AnnexinV-FITC)-/PI+，此区域的细胞为坏死细胞。也可能有少数的晚期凋亡细胞在其中，甚至机械损伤的细胞也包含其中。 Q2: (AnnexinV+FITC)+/PI+，此区域的细胞为晚期凋亡细胞。 Q3：(AnnexinV-FITC)+/PI-，此区域的细胞为早期凋亡细胞。 Q4：(AnnexinV-FITC)-/PI-，此区域的细胞为活细胞。 我去，这图怎么上传，有图的只能割爱了，没法放。 |
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