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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » qPCR标曲正常，但是结果比理论值高1~2个数量级，求大家帮忙分析原因。
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ylian0

木虫 (小有名气)

[交流] qPCR标曲正常，但是结果比理论值高1~2个数量级，求大家帮忙分析原因。

大家好，我这边最近做qPCR绝对定量遇到一个现象，就是qPCR的结果和我的菌液镜检结果相差1~2个数量级，下面把结果和实验中的一些参数给大家看看，请帮忙分析一下。
我的qPCR结果显示我菌液浓度约为8E+11copies/ml，显微镜检结果约为3E+9个/ml。
由于不确定细菌基因拷贝数，假如拷贝数为10，qPCR的结果仍然是8E+10 cell/ml，还是比显微镜检高了1个数量级。
虽然显微镜检也是相对定量，结果有与实际值有偏差，但是10倍差在显微镜下差异还是很大的。

我是提取的质粒DNA，用qubit测的浓度为84ng/μl，目的片段碱基数分别为A:T:C:G=59:50:73:95（合计277），质粒用的pMD-19T碱基数A:T:C:G=662：:69:676:686（合计2693），计算公式为：标品拷贝数=84x(6.02E+23)/(277+2693)/660，质粒标品浓度为2.58E+10 copies/μl，质粒进行10倍梯度稀释取2~8次方进行qPCR检测。

标准曲线参数：扩增效率90.6%，R2=0.999，slope=-3.571
溶剂曲线：单峰，无非特异性扩增

样品DNA稀释100倍进行qPCR检测，下机拷贝数为：1.56E+7 copies/μl
用0.2ml菌液离心洗涤，400μl重悬破壁后取上清200μl提DNA，50μl去离子水洗脱，
DNA拷贝数计算公式为：菌液DNA含量（copies/ml）=（1.56E+7）x100x50x2/0.2，结果约为8E+11copies/ml

小木虫今天没法上传图片，只能辛苦大家看文字版了，谢谢！
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1楼 2020-11-20 15:50:28
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junjieshao

禁虫 (小有名气)
★
ylian0(金币+1): 谢谢参与
本帖内容被屏蔽
4楼2020-11-20 23:44:04
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mariahit

新虫 (初入文坛)
★
ylian0(金币+1): 谢谢参与
引用回帖:
1楼: Originally posted by ylian0 at 2020-11-20 15:50:28
大家好，我这边最近做qPCR绝对定量遇到一个现象，就是qPCR的结果和我的菌液镜检结果相差1~2个数量级，下面把结果和实验中的一些参数给大家看看，请帮忙分析一下。
我的qPCR结果显示我菌液浓度约为8E+11copies/ml， ...

最后没明白为什么要乘以二，而且感觉应该跟质粒的拷贝数进行比较吧，qpcr首次接触，只是个人观点

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14楼2020-11-21 23:47:01
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Taqman-

新虫 (小有名气)
★
ylian0(金币+1): 谢谢参与
(≧ω≦)/

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17楼2020-11-22 22:44:59
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ylian0

木虫 (小有名气)
引用回帖:
14楼: Originally posted by mariahit at 2020-11-21 23:47:01
最后没明白为什么要乘以二，而且感觉应该跟质粒的拷贝数进行比较吧，qpcr首次接触，只是个人观点
...

乘以2是因为在提DNA的过程中，只取了混合菌液一半的液体进行提DNA操作，我们用的beads破壁，不是所有重悬菌液都能用于提DNA。
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25楼2020-11-26 09:21:41
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angkuLC

新虫 (初入文坛)
★
ylian0(金币+1): 谢谢参与
引用回帖:
25楼: Originally posted by ylian0 at 2020-11-26 09:21:41
乘以2是因为在提DNA的过程中，只取了混合菌液一半的液体进行提DNA操作，我们用的beads破壁，不是所有重悬菌液都能用于提DNA。...

请问楼主“beads破壁，不是所有重悬菌液都能用于提DNA”是什么意思呢？

个人感觉解决方法有：1. 如果不知道混合菌液的物种可以做下高通量，然后把含量较高的几个物种所含基因的拷贝数算下；如果知道就直接算拷贝数。2. 测混合菌液OD值估算量级。3. 排除下显微镜镜检的因素：是否只计数荧光细菌，如果是的话是否在培养过程中对是否包含质粒（或此段基因）进行了筛选。按说显微镜镜检应该是最直接的方法。另外，Jeff Gore有几篇文章是采用电镜的方法计数，就是很烧钱……
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27楼2021-10-09 22:02:56
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1822981417

新虫 (初入文坛)
★
ylian0(金币+1): 谢谢参与
你样品提取完成后没有测Dna浓度吗，稀释了一百倍都居然还有1E+7copies/ul那么高，CT值估计都快接近上限了
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29楼2023-08-23 13:55:44
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刘茯柚

新虫 (初入文坛)
★
ylian0(金币+1): 谢谢参与
我最近也遇到这个问题 我在定量大肠杆菌基因组上的单拷贝数的基因 结果发现基因数比我加的大肠杆菌数量（稀释涂板计算）还多一个数量级 心都碎了 楼主最后找到原因了 怎么解决的啊
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30楼2024-01-09 16:15:09
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0362180114

新虫 (初入文坛)
不懂

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31楼2024-01-17 12:22:22
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三岁何啊

新虫 (初入文坛)
我的都做不出来

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32楼2024-08-23 15:54:57
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tzynew2楼
2020-11-20 17:36   回复  
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xiaoqiuqiu203楼
2020-11-20 21:53   回复  
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icanspll5楼
2020-11-21 14:01   回复  
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zzhello6楼
2020-11-21 14:01   回复  
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yaqianye7楼
2020-11-21 14:01   回复  
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蓉蓉番薯8楼
2020-11-21 14:01   回复  
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likecitywo9楼
2020-11-21 14:02   回复  
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Haibo_10楼
2020-11-21 14:04   回复  
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howtoge11楼
2020-11-21 14:05   回复  
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shehuifei12楼
2020-11-21 14:05   回复  
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gofast11213楼
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nono200918楼
2020-11-23 07:07   回复  
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苏州华博19楼
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psylhh20楼
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syhorchid21楼
2020-11-23 23:12   回复  
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苏州华博22楼
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