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核酸检测实验室（PCR）如何消毒？
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摘要：PCR实验，即临床基因扩增实验，是专门用来检验艾滋病、乙型肝炎、禽疫病等病毒感染性疾病的一种检测手段 PCR实验，即临床基因扩增实验，是专门用来检验艾滋病、乙型肝炎、禽疫病等病毒感染性疾病的一种检测手段。它可以通过将病毒体内所含的基因进行扩增的方法，测出一些病毒含量不高的感染者体内是否含有特定的病毒。 而三级综合医院不具备核酸检测能力的少之又少，大多已经实现了PCR实验的基本要求，差别只在于开展项目略有不同，这项要求真正难以落实的主要问题是：二级医院/县医院建立PCR实验室不容易。 就新冠病毒核酸检测来说，RT-PCR是目前使用广泛和较准确的筛选和确认方法，大规模核酸检测，必然会引起相关机构单位着力建设规范的临床PCR实验室。但是，建立一个PCR实验室，其实就是在建设一个平台，考验的不仅仅是一个医疗机构的实验能力，也考验着整个医疗机构的整体能力。下面就为大家整理一下PCR实验室建设及日常管理方面的一些问题。 一、临床基因扩增检验实验室设计的核心问题是什么？ 实验室的平面布局、空调通风 系统设计、气流控制等都是围绕同一个核心问题进行——“避免污染”，任何级别的医院在建设PCR实验室时，均需要提前考量各个因素，以保证标本的全环节质量及实验室的生物安全。 1、建设要求。PCR实验室的建设需要设置标准的“四区”：试剂准备区、标本制备区、PCR扩增检测区和扩增产物检测区。每个独立实验区设置有缓冲区，各区通过气压调节，使整个PCR实验过程中试剂和标本免受气溶胶的污染，并降低扩增产物对人员和环境的污染。 2、人员要求。进入PCR实验室，需要经过从基础理论、实验原理、规范操作、质量保证到注意事项等规范的培训，并获取PCR上岗证。 3、检测风险。检测过程中，样本的开盖，核酸提取的震荡、离心都有可能产生气溶胶，有感染的风险。 4、防护要求。必须按照生物安全三级实验室的个人防护要求进行。 二、PCR实验的污染来源都有哪些？ 1、样本间交叉污染：收集样本的容器被污染或样本密封不严导致外溢；不同样本移液时忘记更换枪尖或未使用带滤芯枪尖；移液器等实验器具及耗材未及时消毒灭菌；不同样本同时开盖或样本剧烈震荡、反复吹吸导致气溶胶形成扩散，相互交叉污染。 2、实验试剂污染：主要是在 PCR 组分试剂加样过程中，由于移液器、容器、阴性对照及其它试剂被核酸模板或阳性对照污染。加样过程中，因为PCR试剂对温度十分敏感，需要通过冰浴使得PCR试剂和PCR板/管处于0℃，但这个过程也充满污染风险。 3、扩增产物污染：大量拷贝的产物泄漏或扩增后的PCR反应管意外开盖，这是PCR反应中主要、常见的污染问题。因为PCR产物拷贝量大，远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污染，就可形成假阳性。 4、克隆质粒污染：作为阳性质控品的克隆质粒外溢。 三、防止实验污染都有哪些措施？ 对于低流行地区，PCR检测人员经过严格培训上岗后，核酸污染的风险相对较小，但在疫区超负荷工作时，就可能会遇到核酸污染的问题，可通过以下措施降低污染机会： 1、正确佩戴手套：手套未紧密贴合拇指、食指和中指，在进行开盖操作时容易发生交叉污染。 2、正确使用生物安全柜：简单、整洁、避免通风口堵塞；操作前后紫外线照射，消毒剂随手可及；废液缸里有1/3体积的含氯消毒液，并且及时清理废液缸，保证废物不超过废液缸体积的2/3。 3、核酸提取仪去污染：每天多批次检测时，在每一批次检测完以后必须用75%的乙醇和核酸去除剂对仪器进行去污染。 4、重视通风：不定期对房间进行通风，每次至少持续30min。 5、PCR扩增区去污染：PCR反应管必须盖紧，避免扩增后的核酸对环境的污染。 6、实验室随手可及的消毒剂。 四、PCR实验室的空气流向管理与环境消毒？ 前面提到，PCR实验室可分为试剂准备区、标本制备区、扩增区和产物检测区四个区域，这四个区域在物理空间上必须完全相互独立，各区域无论是在空间上还是在使用中，应当始终处于完全的分隔状态，不能有空气的直接相通。所以，临床基因扩增检验实验室的空气流向应按：试剂准备区→标本制备区→扩增区→产物检测区，应时刻防止扩增产物顺空气气流进入扩增前区域。可按照上述顺序区域空气压力递减的方式进行，也可通过安装排风扇、负压排风装置或其他可行方式实现。 临床基因扩增检验实验室的环境清洁：《临床基因扩增实验室工作规范》中有对物表清洁、消毒的要求，不同的实验区域应当有其各自的清洁用具以防止交叉污染。 （1）基本原则：由清洁区向污染区进行，洁具不可交叉。 （2）清洁消毒方向：准备区→标本制备区→扩增区→产物检测区。 （3）清洁消毒范围：工作区域的物体表面(含桌、椅)，可使用含氯消毒剂擦拭消毒，空气和工作台面可使用紫外线照射消毒，也可使用空间消毒器进行全环节消毒。不可使用紫外线消毒器及化学消毒进行有人状态下的消毒。PCR室内的消毒应防止扬尘（减少人员走动）、杀灭DNA或RNA的基因片段。可选择悬挂紫外线灯管进行空气消毒，试验前照射30-60分钟，实验结束照射30-60分钟，必要时延长照射时间（可照射一夜）。 （4）终末消毒：当出现实验室污染时，应按要求立即撤出相关人员，在无人情况下可使用化学消毒剂进行终末消毒，如熏蒸法：过氧乙酸1g/ m3加热熏蒸（湿度70-90%），密闭24小时；气溶胶喷雾：3%过氧化氢：20mL/m3气溶胶喷雾；5%过氧乙酸2.5mL/m3气溶胶喷雾（湿度20-40%）。 五、日常清洁消毒应该如何做？ 1、每日工作前后，对工作区域表面、地面进行清洁并消毒，使用含氯消毒液擦拭。清洁采用湿式、不扬尘的方式进行。 2、物品防尘存放。墙面定期清洁，有可见污染及时进行清洁消毒。配备移动紫外线消毒装置进行空气和物表的消毒。 3、生物安全柜的消毒： （1）每天工作前：对生物安全柜的内表面进行消毒，包括工作台面和内壁使用消毒剂擦拭； （2）工作结束：柜内物品全部消毒后移出。消毒剂擦拭台面四周、以及玻璃内侧灯部位； （3）停用生物安全柜前：运行5min以净化内部空气； （4）消毒剂应选择能够杀死生物安全柜里可能发生的任何微生物（70%乙醇、含氯消毒剂）。在使用漂白剂等腐蚀性消毒剂后，还应用无菌水再次进行擦拭； （5）终末消毒：需要进行终末消毒的时机。 六、试验完成后，物品及环境如何处理？ （1）做好废液及固废处理； （2）实验室空间消毒：在室温，50-60%湿度条件下，使用过氧乙酸熏蒸2g/m3，过夜；或使用20g/l气溶胶喷雾，用量8g/m3； （3）物体表面消毒液：0.55%含氯消毒剂，现用现配，24小时内使用。 七、疫情时期的核酸检测新要求 从以上描述不难看出，在当前PCR核酸检测实验室，还是有相当多的约束条件，在需要紧急使用时也是需要较长的准备时间，同时也无法满足当前机场、口岸、社区等基层大规模检测的需要和疫情防控的要求，影响了对患者的及时诊断和治疗。面对新冠病毒此类的疫情防控，急需一种快速、准确、便捷的检测手段！ 这时等温扩增技术也开始出现在更多科研人员的视野中，它不需要专门的实验室，操作人员也不用专业的培训，整体价格也不会特别的昂贵，比如先达基因（gendx.cn）的ERA等温扩增技术，该方法在低温条件下（25-42℃）可对痕量的靶DNA片段进行特异性的扩增，在最适温度35-42℃时，扩增反应时间仅需15分钟，其低温适应性和灵敏度等方面取得了重大突破，这也就为核酸检测走出实验室创造了条件。 该公司将体外逆转录技术（RT）与自主开发的独特等温扩增荧光检测(ERA)技术进行融合开发出全新的RT-ERA技术，根据新型冠状病毒编码Spiker基因的特异性核苷酸序列设计1对引物和荧光探针建立的检测新型冠状病毒的核酸荧光定量扩增方法大量扩增后的产物能够与带有荧光标记的探针相结合，从而产生特定的荧光。该荧光信号可由荧光检测仪器实时捕获，直观反映扩增循环情况。 样品中如果具有微量的新型冠状病毒RNA存在时，则能够通过大量扩增后激发荧光信号，样本显示为阳性；如果样本中不含有新型冠状病毒，仪器会判读为阴性。以此做到快速，简单，准确的检测核酸样本。 同时我们也期待此类技术能更快的应用于实践中，努力做到更好的早发现，早隔离的防疫要求。 |
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