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逆转录 PCR
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逆转录是指以 RNA 为模板，合成与其互补的 cDNA 的过程。逆转录 PCR 是将 RNA 的逆转录（reverse transcription）和 cDNA 的聚合酶链式反应（PCR）相结合的技术，故逆转录称为 RT-PCR 或反转录 PCR。逆转录 PCR 实验原理为：提取组织或细胞中的总 RNA，以 RNA 为模板，首先在利用逆转录酶反转录成 cDNA，再以 cDNA 链为模板进行 PCR 扩增，从而获得大量拷贝。逆转录 PCR 的出现使 RNA 检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量 RNA 样品分析成为可能。 逆转录 PCR 应用 逆转录 PCR 的用途广泛，可用于分析基因的转录产物、检测细胞中 RNA 病毒的含量、合成 cDNA 探针、直接克隆特定基因的 cDNA 序列等。如在临床上 RT-PCR 可以用于遗传病诊断、癌症检测、检测病人标本中的 RNA 病毒，如 HAV、HCR、HIV 等。在植物方面 RT-PCR 常用于研究环境胁迫对植物基因表达的影响，以及在特定的环境或生长阶段中植物体不同部位基因表达的差异性。使用 RT-PCR 检测分析 RNA 转录产物具有以下突出的优点： l 理论上可以检测几乎任何基因的转录产物； l 可以实现极为微量 RNA 样品（ng 级别）的检测； l 样品耐受性好，未经纯化的粗制生物样品也可以用于检测； 模板 逆转录 PCR 的模板是 RNA，可以是总 RNA、mRNA 或体外转录的 RNA 产物。无论使用何种 RNA，都需确保 RNA 中无 RNA 酶和基因组 DNA 的污染。 RNA 提取 可以利用试剂盒从细胞（或组织）中提取得到 RNA。模板 RNA 的纯度和完整性对于扩增的结果有很大影响，从细胞中分离 RNA 应注意尽量减少 RNA 酶的污染（RNA 酶分布广泛，除细胞内源性 RNA 酶外环境中也存在大量 RNA 酶），在提取 RNA 时，应尽量创造一个无 RNA 酶的环境：避免 RNA 酶污染包括去除外源性 RNA 酶污染和抑制内源性 RNA 酶活性，主要是采用焦碳酸二乙酯（DEPC）去除外源性 RNA 酶，通过 RNA 酶的阻抑蛋白 Rnasin 和强力的蛋白质变性剂抑制内源性 RNA 酶。 引物 用于反转录的引物有随机引物、通用引物（Oligo-dT）及基因特异性引物三种 引物最好选择 Oligo-dT 或基因特异性引物，随机引物会从 RNA 的多个位点(包括核糖体 RNA)开始转录，特异性低。Oligo-dT 引物同大多数真核细胞 mRNA3'端的 poly(A)尾杂交，与使用随机引物相比特异性高。但是 Oligo-dT 引物对 RNA 样品的质量要求较高，对于从福尔马林固定的组织中提取的劣质 RNA 不适合用 Oligo-dT 引物。 逆转录酶 逆转录酶是存在于 RNA 病毒体内的依赖 RNA 的 DNA 聚合酶。RT-PCR 实验中的逆转录酶需要具有以下三种活性 1. 依赖 RNA 的 DNA 聚合酶活性：以 RNA 为模板合成 cDNA 的第一条链； 2. Rnase 水解活性：水解 Rnase 杂合体中的 RNA; 3. 依赖 DNA 的 DNA 聚合酶活性：以一条 DNA 链为模板合成互补的双链 DNA 在选择逆转录酶时，建议选择无 RNaseH①活性（RNaseH-）的逆转录酶。具有 RNaseH 活性的逆转录酶的 RNaseH 活性会与聚合酶活性竞争 RNA 模板与 DNA 引物（或 cDNA 延伸链）形成的杂合链，并降解杂合链中的 RNA 链。被 RNaseH 活性所降解的 RNA 模板不能再作为合成 cDNA 的有效底物，降低了 cDNA 合成的产量与长度。 实验流程 从细胞材料中提取 RNA→RNA 加入到含有逆转录酶、引物、dNTPs 的反应体系中→退火，引物与 RNA 链配对→延伸，逆转录酶合成互补 cDNA 链变性→常规 PCR 反应流程（变性、退火、延伸，如此多次循环）。 RT-PCR“两步法”与“一步法” RT-PCR 的实验操作分为“一步法”与“两步法”两种。一步法 RT-PCR 能克隆微量 mRNA 而不需构建 cDNA 文库（即 cDNA 合成与 PCR 反应在同一 Buffer 及酶中进行，一步法完成），省略了 cDNA 与 PCR 之间的过程。两步法 RT-PCR 首先用反转录酶合成 cDNA，然后以 cDNA 为模板进行 PCR，即 RNA 反转录与 PCR 扩增分两步进行。一步法 RT-PCR 与两步法相比快速、简便、减少了污染机会、减少了 RNA 二级结构、减少了 PCR 反应的错配率。RT-PCR 两步法的优势在于存在中间产物 cDNA，便于保存；且第二步 PCR 只取逆转录反应产物的 1/10 进行反应，有利于 PCR 条件的调整，实验重现性强；两步法可以在第二步 PCR 反应体系中加入特异性引物，其灵敏度比一步法高；两步法的实验预算要低于一步法。但是由于两步法包括第一链 cDNA 合成和随后的 PCR 反应，容易产生污染问题。 实验操作注意事项 l RNA 提取一定要迅速，样本要新鲜，组织尽量在液氮中研磨； l RNA 提取完马上进行逆转录不要拖延，新提的 RNA 很容易降解； l 逆转录反应过程，需建立无 RNAase 环境，以避免模板 RNA 降解； 注： ① RNase 是 RNA 水解酶的统称，包含 RNase A，RNase H 等，RNase A 可以水解单双链 RNA，RNase H 主要水解 RNA 与 DNA 杂交双链中的 RNA（转自先达基因 www.gendx.cn） |
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