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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » TAQ酶厂商是怎么确定酶活性的？
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aliaa2019

金虫 (正式写手)

[求助] TAQ酶厂商是怎么确定酶活性的？ 已有1人参与

有没有厂商回答一下啊？


荧光定量PCR？定性PCR？

TAQ酶厂商是怎么确定酶活性的？
esy-023635429.jpg
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1楼 2020-08-26 15:21:53
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aliaa2019

金虫 (正式写手)
@西门吹雪170 @drwhoknowss @渊博震天
@silicare @豆哥 @kk1424
2楼2020-08-26 15:23:42
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wangyuan0929

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
aliaa2019: 金币+15, ★★★很有帮助, 确实是这样，放射性和国内荧光定量是两个最主要的方案，不过有具体点的方案么？ 2020-08-27 07:58:43
https://www.douban.com/group/topic/151823150/

大概思路是两种

1. 用放射性同位素/荧光基团标记的试剂来进行PCR，然后聚合结束后用电泳去除未用完的标记物，最后通过放射性强度或荧光强度来得到聚合酶的反应速度，从而计算酶活（U）。
2. 使用荧光染料插入双链DNA的特性，在聚合过程中使用qPCR设备追踪荧光强度变化曲线，从而推算酶促反应速度，并计算酶活。
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3楼2020-08-26 16:36:34
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junjieshao

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
4楼2020-08-26 21:50:21
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aliaa2019

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by junjieshao at 2020-08-26 21:50:21
Unit Definition
One unit is defined as the amount of enzyme that will incorporate 10 nmol of dNTP into acid insoluble material in 30 minutes at 74°C.

谢谢谢谢，这是标准定义，但是实际操作起来不容易
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5楼2020-08-27 07:59:28
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wangyuan0929

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
aliaa2019: 金币+5, ★★★很有帮助, 好的，谢谢你，1μCi (α-32 P）不好操作 2020-08-27 12:36:36
sigma网站上有：
https://www.sigmaaldrich.com/cat ... h&region=CN

Unit Definition
一个单位 Taq DNA 聚合酶定义为在上述试验条件下，+ 65°C 下 60 分钟 内将10nmol总脱氧核糖核苷三磷酸结合到酸可沉淀DNA中的酶量。

单位含量测定：
孵育缓冲液：
67 mM Tris/HCl；pH 8.3/25°C、5 mM MgCl 2 、10 mM 巯基乙醇、0.2% 聚乙醇、0.2 mg/mL 明胶、 dATP/dGTP/dTTP各0.2 mM 、以及 0.1 mM dCTP。

孵育程序：
M13mp9ss、M13 引物 (17mer) 和 1μCi (α-32 P）dCTP 与 Taq DNA 聚合酶的适当稀释液在 50μl + 65℃ 孵育缓冲液孵育 60 分钟。通过三氯乙酸沉淀测定掺入的 dNTP 的量。

体积活度：1 U/μl
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6楼2020-08-27 10:43:01
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