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＊一一

新虫 (初入文坛)

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[交流] CTC（循环肿瘤细胞）的精准分型和单细胞测序前瞻

2019年4月12日，在中国临床肿瘤学会（CSCO）乳腺癌年会上，江泽飞教授公布了《2019 CSCO乳腺癌诊疗指南》。新《指南》第八部分明确提到循环肿瘤细胞（CTC）：CTC是指从恶性肿瘤原发部位脱落，通过血管或淋巴系统进入血液循环的细胞，它能够反映肿瘤组织的情况，也可以用无创方式替代组织样本进行病理诊断、疾病监测、分子测序等，不仅可以动态监测，还可以用于判断预后。随着对CTC认识的拓展，其应用已经从数目走向了精准分型和单细胞测序时代。

CTC是如何转移的？
实体肿瘤或转移灶的肿瘤细胞在特定条件下，通过上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），从形态上发生向间质细胞表型的转变并获得迁移能力。间充质细胞与上皮细胞相邻，只是其结构松散，缺乏细胞连接（cell adhesion）和细胞极性，并且具有转移和侵袭能力。因此，脱落的CTCs得以进入外周血循环，这是肿瘤发生的必要前提。脱离原发灶入血的CTCs至少面临着血流剪应力、失巢凋亡、免疫细胞识别杀伤等三重致命考验，进入循环的大部分肿瘤细胞都会失去活性，只有不足0.01%可到达远端器官，通过迁移、黏附、相互聚集形成微小癌栓，并在适合的微环境条件下，CTCs又发生间质-上皮转化（mesenchymal-epithelial transition MET），生成新的肿瘤，从而导致肿瘤转移的发生。

CTC的临床意义
1 肿瘤早期诊断
有研究发现，CTC在肺癌临床确诊前，在慢阻肺病人血液中发现，比临床确诊早1-4年不等。因此，CTC检测也可以用于肿瘤的早期诊断。

2 肿瘤预后判断
多中心研究发现：CTC数量多的患者预后明显较CTC数量低的患者差；其PFS和OS均明显短于后者，总体存活时间平均少10个月以上。因此，CTC的数量与预后具有非常显著的相关性。

3 实时监测疗效
研究表明在治疗过程中监测CTC数量的变化，可以得知治疗方案是否有效，是否可以帮助患者控制病情、提高生存期，并协助判断预后情况。

4 制定/调整治疗方案
将CTC捕获出来进行培养，进一步对其进行基因测序、mRNA表达和蛋白表达情况分析，为患者制定/调整治疗方案，达到个体化治疗目的。

CTC的捕获
每10 ml血液中可能仅含有几个到几十个CTC，而含有的白细胞约1亿个，红细胞约500亿个。所以如何将CTC与这些细胞分离呢？目前主要有这三种技术。
（见图1）

技术瓶颈？
CTC的临床试验中广泛使用到的还是十几年前上市的CellSearch平台（免疫磁珠法）。CellSearch平台由强生公司开发，通过EpCAM（上皮细胞黏附分子）富集CTC细胞。这一平台虽然稳定性好，但只能在乳腺癌、结直肠癌和前列腺癌中应用，在一些癌症（如非小细胞肺癌）中灵敏度较低，即使是在晚期肿瘤患者样本中，检出率也并不高。这是因为有部分CTC经过EMT（上皮间质转化）之后，上皮标志物表达量降低同时细胞变形能力增强。这部分细胞会很难被CellSearch平台检测到。
虽然血液中的CTC数目一定是有研究价值的，但要对其价值进行挖掘，关键的一点是要验证获取到的每一个CTC都确定是肿瘤细胞，并挖掘其异质性。这时候就需要对每个被捕获的细胞进行单细胞测序。

CTC的全套解决方案
RareCyte平台提供了从全血到单细胞测序的一体化解决方案。
1 试验思路
（见图2）
2 试验原理
借鉴组织切片研究思路和方法学将细胞样本固定在载玻片上进行后续研究。
（见图3）
3 全球分布式临床试验
简单的操作将全血制成片子，-20℃可以保存超过12个月！

4 试验流程
（见图4）
 AccuCyte®样本制备系统
 分离全血中全部有核细胞。
 将全部有核细胞固定在载玻片上，过程简单、重复性好，无需进行细胞的冲洗、裂解。
 设置了不同的弹性停止点，工作流程弹性强，方便各种场景使用。
 系统设计保证目标细胞几乎无丢失。

 CyteSealer®独有专利的捕获系统
 AccuCyte组件的工程设计可将血液精确分层，将有核细胞层收集到细胞收集管中，最大程度地减少靶细胞的丢失。

 CyteSealer装置对分离管周围的可变形金属环施加均匀的高压，浮起浮漂以形成不可逆的密封。在有核细胞层和浮漂下面的红细胞之间形成了一个永久的屏障。

 RarePlexTM多靶点染色解决方案
 基于RarePlex™ 的试剂盒+定制Markers（4+2或3+3）。
 RareCyte 已有的Marker 列表中选择完成Panel组合。
 RarePlex 染色试剂盒完全兼容Leica 和Dako/Ventana 全自动染色机。
（见图5）

 CyteFinder®全景成像
 7荧光通道全自动、高速全景扫描涂片。
 对血液、穿刺样本或细胞样本进行全景成像。
 弹性的显微成像体系可方便的融入任何常规或定制分析的流程，进行样本追踪和数据管理。

 CyteMapper®精准分型数据库
 基于500+参数，5000多病例的CTC精准分型数据库对CTC进行智能识别、计数和分型。
 机器学习智能识别目标细胞，并对目标细胞进行优先级排序，便于用户浏览确认。
 CytePicker®单细胞提取系统
 基于针头式的物理方法的单细胞提取，不破坏DNA/RNA。
 单个细胞从玻片提取到PCR管中，提取结果确认。
 进行后续的DNA/RNA转录组学&基因组学研究。

5 与CellSearch的结果对比
对前列腺癌的100多名患者和乳腺癌的上千名患者样本进行检测，可以看到，无论是前列腺癌还是乳腺癌，RareCyte的线性关系都要稍优于CellSearch。
可以保证有核细胞的无损捕获/细胞RNA无损伤！

6 平台优势
RareCyte唯一实现个位数稀有细胞捕获的平台！
 AccuCyte稀有细胞涂片制备
基于离心的原理，专利的产品保证有核细胞的几乎无损失捕获；
无需红细胞裂解液，因此不降解细胞。
 无偏见
所有的有核细胞均在收集于玻片上。
 特异性
多达6-7个通道的多靶标检测，精准分型。

附：RareCyte除了CTC的应用，在无创产前筛查和药物伴随诊断领域均展现了巨大的应用潜力。

参考文献
赵丽娜，赵晓航. 循环肿瘤细胞单细胞测序——液体活检的新视角[J]. 生命科学, 2018,30(1)：63-73.
Inhestern J, Oertel K, Stemmann V, et al. Prognostic Role of CirculatingTumor Cells during Induction Chemotherapy Followed by Curative Surgery Combinedwith Postoperative Radiotherapy in Patients with Locally Advanced Oral andOropharyngeal Squamous Cell Cancer[J]. Plos One, 2015, 10(7).
Li T T, Liu H, Li F P, et al. Evaluation ofepithelial-mesenchymal transitioned circulating tumor cells in patients withresectable gastric cancer: Relevance to therapy response[J]. World Journal ofGastroenterology, 2015, 21(47):13259.
Liu Y, Ling Y, Qi Q, et al. Prognostic valueof circulating tumor cells in advanced gastric cancer patients receivingchemotherapy.[J]. Molecular & Clinical Oncology, 2017, 6(2):235.
Nieva J, Wendel M, Luttgen M S, et al. High-definition imaging of circulating tumor cells and associated cellularevents in non-small cell lung cancer patients: a longitudinal analysis.[J]. Physical Biology, 2012, 9(1).

图2