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[交流]
多重荧光免疫组化服务
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【技术原理】 多重免疫组化，主要的技术原理来自TSA技术，TSA即酪酰胺信号放大(Tyramide signal amplification)是一类利用辣根过氧化酶（HRP）对靶蛋白或核酸进行高密度原位标记的酶学检测方法。该技术可与高性能染料Alexa Fluor®、传统荧光染料和比色检测系统相兼容。 TSA主要原理是利用酪胺Tyramide的过氧化物酶反应(酪胺盐在HRP催化H202下形成共价键结合位点)，产生大量的酶促产物，该产物能与周围的蛋白残基(包括色氨酸、组氨酸和酪氨酸残基)结合，这样在抗原-抗体结合部位就有大量的生物素沉积，与随后加入的Streptavidin—HRP/荧光基团结合，经几次这样的循环放大，可以结合大量的酶分子or荧光基团，结果使其检测信号得到几何级放大。  简单来说，用这种方法做多重免疫荧光是利用二抗上带有的HRP（而不是直接偶联荧光素），来催化后续添加入体系的非活性荧光素。荧光素在HRP和过氧化氢的作用下被活化，跟临近蛋白的酪氨酸残基共价偶联，使得蛋白样品与荧光素稳定结合。 然后微波处理，前一轮非共价结合的抗体被洗掉，共价结合的荧光素还留存在样品上。再换个一抗来第二轮孵育，周而复始。等到所有抗体孵育结束，荧光素都结合好后，最后去检测结果。  【技术优势】 1.由于每次体系中都只有单一抗体孵育，因此无需担心抗体交叉反应，以及一抗二抗种属匹配问题，大大减少了实验设计时不同种属抗体选择匹配的限制。 2.TSA技术可以用于检测用传统方法无法检出的低丰度靶标。基于酪酰胺的信号放大技术能够提供极强的敏感度、检测极微量的目的抗原。极大的降低抗体的用量，节约抗体，实测确实可以显著提升抗体的稀释比例。 3. 荧光法多重免疫组化，可同时进行五个颜色通道以上，这种情况下发射光谱会重叠，我们可以借助多光谱成像系统来解决这个问题。这是传统间接荧光法染色和显色法多重免疫组化所做不到的。这种方法能真实反映关键蛋白的表达情况和相互之间的关系，从而极大地节约珍贵的样品。 【结果案例展示】 1.人 T细胞活化状态检测 CD3 CD69 HLA-DR  2.类器官体外检测、肿瘤标志物检测  3.同源小鼠肿瘤PD实验  【代表文献（精选）】  黑色素瘤组织,CD8,PD1,S100,Sox10,PD-1药物抗性及病人复发机制Zaretsky, J. M., et al. (2016). "Mutations Associated with Acquired Re-sistance to PD-1 Blockade in Melanoma." N Engl J Med 375(9): 819-29. IF 59.558  Merkel细胞癌组织,NSE,CD8,CD68,PD1,PD-L1综合分析免疫治疗前后肿瘤组织微环境状态变化Nghiem, P. T., et al. (2016). "PD-1 Blockade with Pembrolizumab in Ad-vanced Merkel-Cell Carcinoma." N Engl J Med 374(26): 2542-52. IF 59.558  胰腺癌.Snail,Twist, Snail 对EMT（上皮间质转化）的影响Nature. 2015 November 26; 527(7579): 525–530. doi:10.1038/nature16064.  肝癌组织,CD3,CD68,肝癌免疫景观分析决定PD-L1异质性与治疗敏感性中山大学郑利民教授 The Journal of Clinical Investigation,J Clin Invest. 2019. 【多重荧光免疫组化服务】咨询 * 可以提供的服务： 最多四指标五色（含DAPI）的多色免疫组化服务，样本涵盖人、小鼠、大鼠的石蜡切片及组织芯片（TMA），并提供全片扫描和区域分析。 * 可以提供的服务结果： 1.全片200X（相当于物镜20X，目镜10X）原图，提供看图软件可在客户端打开。数据上传网盘1G以内，或用U盘寄送1G以上。 2.客户指定区域的单细胞分析结果： 单阳性细胞占有核细胞百分比，密度。 双阳性或3阳性细胞占有核细胞百分比，密度。 组织面积和特定病理形态面积计算。 TMA提供每个芯点的以上定量结果，并提供热图。 * 下表是已验证的过的抗体列表（已优化过条件，无需再提供一抗，不在此列表的指标需要提供一抗，我们预实验先行验证，更新指标可定期咨询销售） |
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