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新虫 (小有名气)

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[交流] 细胞污染的种类及检测方法已有2人参与

（一）细菌、真菌污染的检测
1.肉眼观察
细菌、真菌污染常在传代、换液、加样等开放性操作之后发生，而且增生迅速，若有污染，在48小时内可明显观察到。
2.接种观察
采用普通肉汤接种或用未加双抗药物的培养液接种，也可发现是否有污染。
3.显微镜下观察
在倒置显微镜的高倍镜下可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮，即为细菌污染；若细胞之间有丝状、管状、树枝状或卵形的物质常为真菌污染。

（二）杆菌污染检测
1.显微镜下观察
在倒置显微镜的高倍镜下可见培养液中有大量杆状游动的小虫子，前期培养液不浑浊，对各种抗生素无效，难以清除，换掖冲洗后也无效。
2.测序验证
取适量培养液提基因组送测序，然后分析测序结果判断为杆菌污染。

（三）支原体污染的检测
1.显微镜观察
直接取少许培养液滴在载物片上，再盖上盖片观察，支原体在镜下呈黑色微小颗粒，多位于细胞与细胞之间。应注意与细胞破碎溢出的内容物如线粒体等区别开来。
2.PCR检测（MycoTest™ Kit）
利用降落聚合酶链式反应技术（TD-PCR）对支原体16S rRNA 基因高度保守区域特异性片段进行扩增检测。如果有支原体污染即可在400～600bp左右能看到一条很亮的条带。
该方法优点：快速，特异性强适用于一般实验室支原体检测预防。
3.ERA检测（先达基因）
用酶促重组等温扩增技术（ERA技术）和单分子荧光检验技术（SM@RT），在恒定温度（37℃）下可对特异基因进行扩增及定性检测，通过实时荧光扩增曲线，在20分钟内即可判断样品中是否含特异基因，检测过程无需开盖，避免气溶胶的产生，结果可靠性大幅度提高。
4.荧光染色法观察
用荧光染料与DNA特异地结合，可使支原体内的DNA着色，荧光显微镜下支原体成绿色小点，散于细胞周围或附于细胞表面。
5.电镜检测
若条件许可，可用扫描电镜或投射电镜观察。一般在细胞培养48-72小时，细胞接近汇合前，用胰酶消化细胞制成细胞悬液后进行固定、包埋、切片后才能进行观察。
6.培养检测
将细胞悬液5mL加入45mL支原体肉汤培养基，培养14天后观察肉汤培养基有无雾状沉淀，然后取0.5mL加入已冷却到50℃的培养基中，再用琼脂培养基做分离培养，37℃培养3天观察有无“荷包蛋”菌落出现。

（四）黑胶虫污染的检测
1.显微镜观察
在显微镜的高倍镜下可见培养液中有小黑点状颗粒，并在原点做布朗运动或震动，即为大致判断为黑胶虫污染。黑胶虫比细胞体积小很多，主要分布在细胞间隙。
黑胶虫污染前期细胞无明显变化，培养液中有少许做布朗运动的小黑点，污染后期小黑点会迅速增殖导致细胞出现裂解死亡。细胞勤换液可以稍微缓解黑胶虫增殖速度，但无法摆脱污染。
2.PCR检测
利用聚合酶链式反应技术（PCR）对黑胶虫基因组进行特异性扩增检测。
4.ERA检测
用酶促重组等温扩增技术（ERA技术）对齐基因组进行特异性等温扩增检测

（五）病毒的检测
1.应用电镜技术快速诊断动物病毒病。
2.逆转录-聚合酶链式反应RT-PCR检测病毒。
3.酶促重组等温扩增检测病毒。

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