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WB/IHC/Elisa实验封闭剂的种类及选择 已有1人参与
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封闭的原理： 固相载体表面(如elisa板，NC膜或者PVDF膜上等)有很多孔洞，通过电转或包被，胶上的蛋白被转移到了膜上，或抗原/抗体固定在板上，蛋白以机械填补(堆积)和吸附的方式结合于表面。 蛋白塞进了表面的很多孔洞里面，但蛋白并不是连续的，有很多空隙，而且比如说样品孔之间也有空隙，这些孔洞并没有填进东西，而抗体也是蛋白，也会被吸附在空的洞里，这样就会有很多非特异性的信号。 封闭液中的蛋白可以与表面上的空白空洞位置结合，同样以机械填补(堆积)和吸附覆盖的方式结合在膜上，因为有“填补”和“覆盖”蛋白结合位点以避免一抗的非特异结合，所以有“封闭”的说法。同样这两种作用使封闭液中的蛋白能够很牢固的结合在空白位置上。这样抗体蛋白就不会被非特异性的吸附到膜上，而只会跟特异性蛋白结合。 封闭剂应封闭所有的未结合位点而不替换表面上的靶蛋白、不结合靶蛋白表位、也不与抗体或检测试剂有交叉反应。 封闭的目的 避免高背景和非特异性条带 封闭所用试剂的选择： 最常见的封闭剂是：BSA（牛血清白蛋白）、脱脂奶粉、酪蛋白、明胶和Tween-20(0.05 - 0.1%)稀溶液PBST或者TBST。 1、 BSA BSA是最常用的封闭剂，成分单一适用于大多数情况。若免疫原是偶联BSA的， BSA有很强的免疫原性，会导致产生很多的针对BSA的抗体，为避免交叉反应，不能用BSA、脱脂奶粉等封闭，可以选用酪蛋白或无蛋白的封闭剂封闭。 大部分BSA中有少量的抗体残留，会导致抗原/抗体之间的交叉反应，产生高背景，杂带较多或使得本底水平增高。 2、 血清 封闭血清的原理主要有两点，第一是待检样本会有些与蛋白非特异性结合的物质，从而导致背景过高，因此可以用BSA或血清封闭掉这部分非特异性的结合，从这点看，BSA和血清没有明显区别。第二是待检样本中可能会有Fc受体，可以和抗体恒定区结合，与抗体特异性无关，封闭血清中有抗体，因此用血清可以封闭掉一抗及二抗和样本Fc受体之间结合。BSA则无法封闭Fc受体。 免疫组化中用血清封闭的较多。封闭血清一般选择和二抗同一来源的，血清中动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合，否则在后面的步骤中如果和二抗发生结合， 会造成背景。但要注意封闭用血清中不能含有目标蛋白，且与一抗来源不同。另外二抗因尽量少选取兔子或老鼠来源的，因为这两个在亲缘关系上和人类非常接近，所以产生交叉反应的机会就比较大，从而导致背景比较高。适合选用来源于驴，山羊，绵羊等的二抗，背景相对就很低。 3、 脱脂奶粉 脱脂奶粉最大的优点是价钱便宜，所以是首选，但是由于成分相对复杂，所以适用范围要狭窄一些。磷酸化抗体也许会导致背景增加，此外，因为自身含有生物素,不能用于生物素标记的抗体系统。 奶粉蛋白种类比BSA多，而WB膜也好，ELISA板也好，表面的微结构都不是那么均匀的，相对而言，不同分子量蛋白种类多的奶粉(BSA只是一种蛋白)，封闭起来更全面。 脱脂奶粉中含有少量的生物素和碱性磷酸酶残留，在使用生物素-亲和素系统和碱性磷酸酶标记的二抗时，也会使得高背景或本底水平增高。 由于奶粉的成份复杂，而且封闭后的载体不易长期保存，因此在试剂盒的制备中较少应用。 4、 酪蛋白 和BSA作用类似，普通酪蛋白不易溶解。中性和碱性条件下带有负电性，与同样带负电荷胶体金之间存在排斥力，而膜一般都是带正电荷，会与酪蛋白有一定的吸附作用，用酪蛋白封闭效果好些。 5、 无蛋白化合物 甲醛：与PVDF膜表面的微结构反应或者结合，使之失去结合蛋白的疏水力或者空间结构域。 去污剂(吐温-20)：Tween-20是一种非离子型去污剂，有复性抗原的作用，与膜疏水性吸附，有很强的对非特异性吸附的洗脱作用，同样可以降低蛋白间的疏水作用，可提高特异性的识别能力。在做westen blot时，用惰性蛋白质或非离子去污剂封闭膜上的未结合位点可以降低抗体的非特异性结合。Tween 这种非离子型去污剂在乳化蛋白时，不破坏蛋白的结构，可减少对蛋白质之间原有的相互作用的破坏。离子型去污剂如SDS则破坏蛋白的结构。 还有明胶，PEG等也可作为封闭剂。 封闭剂选择的特殊情况： 1.脱脂奶粉不能与生物素化或伴刀豆蛋白标记的抗体一起使用，因为脱脂奶粉含有糖蛋白和生物素。 2.如果封闭剂中含磷酸酶，用磷酸化特异性抗体分析磷酸化蛋白受到影响，因为磷酸酶与印记膜上的磷酸化蛋白接触可使之去磷酸化。 3.检测磷酸化抗体时，不能使用酪蛋白/脱脂奶粉作为封闭剂。 一般封闭条件为： 室温或者 37℃缓慢摇荡1～2 h，特殊情况也可 4℃过夜。根据结果情况调整封闭试剂的浓度和类型。比如脱脂奶粉的封闭效果更强，但有时 BSA 比脱脂奶粉更有利于降低非特异性背景，而有些抗体则在脱脂奶粉封闭的情况下才能得到清晰的背景。 |
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