[交流] wb实验常见诊断报告和优化方案 已有1人参与

实验案例1：泳道高背景 问题分析：多条带以及高背景集中在泳道上，大概率是样本时间太久，或者蛋白酶抑制剂没加发生了蛋白降解，或者是组织样本中，成分太复杂，加上抗体特异性一般造成的。         问题诊断 1. 样本时间太久 2. 组织样本背景高 3. 蛋白酶抑制剂/磷酸酶抑制剂没有加 建议方案 新鲜制备样本，加入蛋白酶抑制剂。对于组织样本，要求超声。对于特异性一般的抗体，先用细胞样本做下。    实验案例2：全膜高背景 问题分析：像这种全膜的高背景，大概率是缓冲液的问题。可以提高封闭液浓度和封闭时间，抗体稀释液使用5%脱脂牛奶或者根据说明书要求来，洗涤的TBST增加nacl浓度以及吐温浓度，增加洗涤的次数和时间。         问题诊断 1. 封闭液 2. 抗体稀释液 3. 洗涤 建议方案 封闭液使用5%脱脂牛奶（新鲜配置），4度封闭过夜。抗体稀释液使用5%脱脂牛奶，TBST中nacl浓度增加至500mM，吐温增加至0.5%，洗涤15min*3次或者10min*4次。 PS：这个case客户本来使用1%BSA稀释抗体，换用5%BSA，背景就没问题了    实验案例3：全膜高背景 问题分析：排除二抗非特异性，就是不加一抗，直接加二抗孵育，看是否有非特异性条带，对于一般客户来说，更换二抗是更加简便的方法。（能拿结果，不仅仅验证），二抗稀释液强烈推荐5%脱脂牛奶，如果前两者都无法改善结果，考虑一抗非特异性。         问题诊断 1. 二抗非特异性 2. 抗体稀释液 3. 一抗非特异性 建议方案 更换二抗，排除二抗非特异西，二抗稀释液使用5%脱脂牛奶，更换一抗。 更换二抗后【如左图】    实验案例4：高背景、杂带 问题分析：全膜的背景问题，主要是一抗二抗未洗涤干净，基本残留在膜上。         问题诊断 1. 洗涤不充分 建议方案 TBST中nacl浓度增加至500mM，吐温增加至0.5%，洗涤15min*3次或者10min*4次 优化后结果【如左图】    实验案例5：条带过粗、杂带 问题分析：条带过于粗往往是因为样本上样量太高，一抗浓度高，加上曝光时间久。         问题诊断 1. 样本信号太强 2. 杂带多 3. 曝光时间太久 建议方案 减少上样量，减少一抗浓度，减少曝光时间。 优化后结果【如左图】    实验案例6：不出带 问题分析：一般没条带的主要关注样本表达量，文献或者看上下游蛋白结果，如果是磷酸化的，还要看上下游的磷酸化。对于大分子量（150KD以上）或者小分子蛋白（小于20KD），看下丽春红染色，确认转膜效率。抗体浓度和曝光时间帮助增强信号。         问题诊断 1. 样本表达量和处理方式 2. 转膜 3. 抗体浓度 4. 曝光时间 建议方案 增加上样量，使用合适的刺激处理方式，增加阳性

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