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免疫印迹(wb实验)常见问题解答 已有2人参与
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1）如果没有注明可以用来做Western blot的一抗，可以用于Western blot实验吗？ 这个要看情况的，因为有的抗体是识别线性表位的,有的是识别构象型表位的，识别构象型表位的抗体不能用于Western blotting实验，因为在Western blotting中抗体识别的是完全变性的蛋白质抗原，而蛋白质抗原的构象型表位变性时被破坏。 2）做wb实验每次只加一种一抗，可以同时加两种或者多种一抗的吗？ 最好还是不要同时加两种及两种以上一抗。因为如果结果里面有非特异信号的话，就说不清楚了。做免疫印迹实验中在同一张膜上检测目的蛋白和内对照，也是先上目的蛋白的一抗、二抗，ECL发光检测、压片、洗片；漂洗以后，再上内对照的一抗、二抗，ECL发光检测、压片、洗片。 3）wb实验中用一抗,单抗好些还是用二抗及多抗好些？用于Western blot的抗体和用于ELISA的抗体有什么不同的要求？ 作为Western blot来讲，理论上单抗比多抗的特异性要好，但单抗种类较少一般价格偏高，爱必信的一抗，种类比较全，价格也比较合理。用于wb实验的抗体和用于ELISA实验的抗体，一般来说用于Western blot 实验的抗体识别的是氨基酸序列特异性；而可用于ELISA实验的抗体则要看抗原种类，有些是识别氨基酸序列特异性，有些是识别构像特异性。所以一般根据抗体说明书来确定。 做免疫印迹实验时选择抗体主要应考虑两个问题，一是所选抗体是否能识别凝胶电泳后转印至膜上的变性蛋白，另一个是所选抗体是否会引起交叉反应条带。 4）结合ECL化学发光检测之后显影发现胶片上的条带是空心的，而且荧光很快就没了？ 一种情况是POD浓度高ECL很快被淬灭掉，导致蛋白丰度越高的地方反而没带，边缘地带反而有显色。 5）要做磷酸化某因子Western blot实验，其二抗有何要求？ 这个对二抗无要求，要看你实验条件来选择，一般推荐用HRP标记的二抗，爱必信二抗的质量过硬，价格公道且种类比较全，建议爱必信网站查一下。 6）WB实验使用的膜哪种最好啊，PVDF好还是NC膜，两者如何选择？ PVDF膜价格相对NC较贵，但可重复使用，特别适合蛋白印迹，结合能力较强。 NC膜价格比较便宜，应用较广，结合牢固性差一些，韧性也不如PVDF，不能重复使用，但蛋白吸附容量高，亲水性较好。具体使用还要参考相关实验需求。 7）半干转膜是否要求膜，滤纸，胶同样大小？因为胶大小不一定规则，膜和滤纸会大一点，那样会不会短路？什么是短路？如何控制和发现短路呢？ 可以相等，但是如果纸、膜比凝胶大就比较容易形成短路了，上下两层虑纸也不能因过大而相互接触，这样同样会短路，电流不会通过胶和虑纸。转移前和转移过程中看看电压就行，正常的半干是慢慢变高的， 最后结束时一般是开始的1.5-3倍都是正常的。一般Buffer和滤纸选的对就不会短路。 8）Western blot实验哪种染色好？ ● 阴离子染料是较常用的，特别是氨基黑，脱色快，背景低检测极限可达到1.5μg，考马斯亮蓝虽然与氨基黑有相同的灵敏度，但脱色慢，背景高。丽春红S和快绿在检测后容易从蛋白质中除去 ，以便进行随后的氨基酸分析。缺点是：溶剂系统的甲醇会引起硝化纤维素膜的 皱缩或破坏。不能用语正电贺的膜。灵敏度低。 ● 胶体金，灵敏度高，检测范围可到pg级，但染色比稳定。 ● 生物素化灵敏度位于1、2之间，可用于任何一种膜。 9）wb实验中，如果不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上， 转移效率低怎么样解决？ 可以考虑：转移缓冲液中加入20%甲醇（是指终浓度）(优化的转移缓冲液，可以参考《爱必信实验指南之Western blot手册》)，因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率，但可增加蛋白质和NC膜的结合能力，甲醇可以防止凝胶变形，甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间；转移缓冲液加入终浓度0.1%SDS，也是为了增加转移效率；用优质的转移膜，或使用小孔径的NC膜（0.2微米）；使用戊二醛交联；低浓度胶，如低至6％。太大时还可以考虑用琼脂糖胶；提高转移电压／电流；增加转移时间 10）蛋白免疫印迹实验时，PVDF膜重复利用几次？ 重复利用指的是可以在显影定影完成以后重新洗脱（stripping buffer）然后重新封闭，一抗（可以是不同的，前提是目的蛋白在pvdf膜上），二抗孵育，显影定影。重复利用的情况还要看实验你的蛋白丰度 ，每一次stripping都会洗掉蛋白，同时有些抗体结合紧的也洗不完全，所以要看根据具体实验情况而定。 |
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