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Western Blot进阶技巧第一弹——从了解目的蛋白开始 已有4人参与
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蛋白质印迹 (Western Blot)，相信大家对此都不陌生，做为检测蛋白表达及半定量的基础实验方法，也是很多小伙伴们初入实验室的第一门课。 “上手容易，精通难”可谓对WB实验的最佳注释，初入实验室的“菜鸟”可以很快上手，做出漂亮的条带，做过多年的“大神”也可能一着不慎，实验“翻车”，结果一塌糊涂。有些实验室甚至流传着一些所谓的“玄学”，新手人品好，难做的条带给新手做等等。 真的是这样么？实验技术可不是拼人品，靠运气的事儿，接下来小编将会为大家带来WB进阶技巧系列，干货满满，让大家提升WB实验技巧，成为真正的实验“大神”。 首先，让我们了解一下什么是WB实验吧： ▲【定义】WB又称为免疫印迹 (immune blot) ，是根据抗原抗体的特异性结合半定量的检测样品中的某种蛋白的方法。 ▲【原理】通过凝胶电泳，将不同分子量大小的蛋白质分离开，再利用特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。 ▲【应用】定性检测：目标蛋白有无，分子量大小；定量检测：检测目标蛋白含量（半定量）。  图1. WB操作流程图 看到这，相信之前对WB了解不多的同学也应该对WB有了一个基础的认识。那么，怎样可以把这看似简单的几步做好，拿到漂亮的实验结果呢？话不多说，上干货。 小编首先要强调的一点，就是了解目的蛋白，这也是今天这篇文章主要给大家分享的内容。可能有的小伙伴会有疑问，为什么要讲一个跟WB操作没关系的步骤呢？说好的WB进阶呢？其实，这往往是很多新手忽视的关键点，对目的蛋白一知半解，是没有办法做好WB实验的，其他免疫学实验也是一样，可能有的小伙伴还不是特别相信，接下来让小编带大家看看为什么了解目的蛋白是如此的重要吧~ 了解目的蛋白对整个WB 实验的重要性： 1.了解目的蛋白，才知道目的蛋白在实验样品中是否有表达 WB实验检测，很多小伙伴会遇到的问题之一就是无条带，也就是阴性结果，如何判断阴性结果是实验操作问题造成的“假阴性”还是本该如此的“真阴性”，这就需要大家在实验前，就对目的蛋白有一个清晰的认识。很多蛋白的表达是有组织特异性的，例如IL-10R，在视网膜，脾脏和肺腺癌组织中有高表达，其他组织表达含量较低；还有一些蛋白，则需要特定的刺激条件才会高表达，这种情况往往在磷酸化蛋白及炎症因子蛋白等中较为常见，如果未做特殊的处理，目的蛋白表达含量很低，无法被WB检测出。 2.了解目的蛋白，才知道如何制备样本 样本制备也是WB的关键步骤，后续的文章中也会为大家详细分析。如何选择合适的样本制备方法，关键因素就是要了解目的蛋白；除了上面第一步中的要了解目的蛋白表达组织，及预处理条件外，还需确认目的蛋白表达的亚细胞定位，例如，细胞膜蛋白，核蛋白，线粒体蛋白和胞浆蛋白的提取方式都不一样，选择合适的方式，才能制备合格的样品，方便后续的WB实验。另外一个需要注意的因素就是需要加入对应的蛋白酶抑制剂，这一点对于磷酸化的蛋白尤为重要，否则蛋白在提取过程中就被降解，会造成“假阴性”结果。  3. 了解目的蛋白，才知道如何选择内参 内参抗体，是WB实验中的重要参考，WB可以对目的蛋白进行半定量分析，判断不同样品中目的蛋白表达含量的多少，就是取决于内参的标定。内参选择在WB实验中是很关键的因素，可不是GAPDH或者β-actin万用的哦。内参如何选择，最重要的决定因素就是目的蛋白，尤其是目的蛋白的表达位置及预处理条件。小编在这里总结了一下内参的选择表，大家可以保存哦~  好了，相信大家应该知道实验前了解目的蛋白的重要性了吧，如何了解目的蛋白呢？可以通过UniProt网站搜寻蛋白的相关信息，也可以在Pubmed上查阅对应的研究文献，相信聪明的小伙伴们肯定可以做好的，今天的分享就先到这，接下来我们还会分享整个WB操作过程中的细节，如果您也有实验心得想分享给大家，欢迎投稿！ |
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