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【代谢组学】核磁共振和质谱的优缺点—针对代谢组学研究
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主要内容： 1. 核磁共振和质谱的概述 2. 核磁共振和质谱的技术比较 1.核磁共振和质谱概述 1.1 代谢组学技术概述 代谢组学分析可分为靶向分析和非靶向分析。非靶向分析侧重于样本中代谢物总量（“指纹”）的代谢谱分析。 核磁共振通常用于代谢组学指纹图谱研究。 靶向代谢组学方法侧重于定量和鉴定所选代谢物，例如涉及特定代谢途径的代谢物或其他作为药物服用或食物摄入直接产物的代谢物。在靶向代谢物分析中，通常已知正在研究的代谢物，并且可以调整样品的制备以减少相关代谢物干扰的影响。 基于质谱的代谢组学方法通常是靶向分析的最佳方法。 质谱分析方法和仪器的不断发展提供了一种高度特异的分析工具，它可以提供化学信息，如用于确定元素公式的准确质量、同位素分布模式，通过母离子和碎片离子的特性进行结构解析，利用光谱匹配法对真实化合物数据进行鉴别，并比较不同化学品在混合样品中的浓度水平。 与核磁共振波谱相比，质谱在分析次级代谢物方面具有优势。此外，不同的质谱技术提供了一系列可应用的工作原理，例如不同的电离技术，因此可能增加代谢物检测到的数量。 核磁共振波谱的高重复性以及非破坏性和非侵入性是核磁共振在代谢组学研究中的重要优势。 此外，核磁共振可用于体内研究，称为磁共振波谱（MRS）；任何通过核磁共振波谱研究的体外代谢物途径都可通过使用MRS进行体内研究。基于核磁共振的代谢组学方法涉及同位素标记的核，如13C和15N，可用于获得有用的信息，如关于生物系统中代谢物的平衡和通过代谢途径监测化合物的流动。 在短短几分钟内即可同时检测到大量代谢物，这进一步说明了核磁共振波谱在代谢组学研究中的优势。例如，一个质子核磁共振谱可以量化人类尿液样本中大约100种代谢物，这就提供了一个给定时间点人类代谢状况的全面图像。此外，高分辨率魔角旋转（HRMAS）核磁共振波谱可用于完整组织样品的研究，从而无需提取等预处理步骤即可检测组织中存在的代谢物。 没有一个单一的分析平台能够对样品中的所有分子进行完全的定量和鉴定。因此，除了一维和二维核磁共振实验外，还需要采用不同的电离方法、液相色谱-质谱（LC-MS）和气相色谱-质谱（GC-MS）等技术，以最大限度地鉴定复杂样品中的不同代谢物。 NMR、GC-MS、直接流动注射质谱（DFI/LC-MS/MS）、电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）和高效液相色谱（HPLC）的结合应用等等。 2. 核磁共振和质谱技术比较 2.1 NMR 核磁共振波谱主要用于化学鉴定和量化给定样品的化学成分。核磁共振波谱的应用不仅限于液体样品，还可用于固体、气相和组织样品。此外，核磁共振除了在分子鉴定和结构解析中的主要应用外，还可以用来研究分子的物理化学性质，如电子密度和分子动力学。因此，核磁共振已成为结构生物学研究的主要工具，因为它使研究人员能够在生物条件下研究分子结构和分子动力学。此外，核磁共振波谱已被广泛应用于结构生物学、有机化学、无机化学、生物化学、物理学、生物学、高分子和药物发现等研究领域。 核磁共振波谱已被认为是代谢组学应用中最相关的方法之一，例如，作为一种对多种人类疾病的强有力的诊断方法。低灵敏度是核磁共振在生物医学研究中应用的固有缺点和首要挑战。相关机械的不断发展，如更高的磁场强度、低温冷却探针和微探针，都显著提高了核磁共振的灵敏度。动态核极化（DNP）方法是近年来发展起来的一种有效的提高核磁共振成像和光谱灵敏度的方法。 2.1.1 高分辨魔角旋转（HRMAS）核磁共振波谱 核磁共振波谱的应用不局限于液体和固体样品，而是通过高分辨率魔角旋转（HRMAS）核磁共振波谱扩展到完整的组织样品。以54.74°“魔角”的角度旋转样品到磁场中并高速旋转，可以获得与溶液态核磁共振谱相当的分辨率的光谱。 使用这种方法，组织样品的化学成分可以在不需要提取等预处理步骤的情况下自动检测。 在基于核磁共振的代谢组学方法中，该技术有助于提供生物流体的代谢剖面与特定组织的组织学之间的相关性。因此，HRMAS核磁共振波谱已经被用来研究包括脑、肾、肝和睾丸组织在内的小的完整组织样品的代谢平衡。HRMAS作为鉴别典型脑膜瘤和良性组织的一种有潜力的诊断工具，近年来被广泛应用于脑膜瘤活检。 2.1.2 一维（1D）核磁共振波谱 尽管核磁共振波谱已被用于许多具有不同可检测核的多维实验，但一维质子核磁共振仍然是最有用的技术，特别是在代谢组学研究中。然而，由于化学位移的范围很窄（10ppm），重叠信号的1H NMR谱通常会持续存在，这导致谱的比对不确定。 图中显示了由正丙醇和正丁醇两个简单分子组成的样品的质子核磁共振谱。从图中可以看出，正丙醇和正丁醇的甲基的信号在0.92ppm处都是重叠信号，不能用简单的1D核磁共振谱来分辨。此外，在1.55ppm下也获得了重叠信号。这些重叠的信号与来自两个分子的-CH2-基团有关，但是根据简单的1D质子核磁共振谱，不可能将特定的信号归因于特定的分子。 其他原子核如碳和氮的核磁共振化学位移范围更广，但也带来了其他限制。例如，一维磷（31P）核磁共振谱具有31P核天然丰度100%，化学位移范围宽，灵敏度高等优点。因此，31P NMR谱通常被用来研究与能量代谢有关的磷脂和代谢物。然而，大多数代谢物不含磷这一事实代表了31P NMR谱的主要局限性。通常，一维碳（13C）核磁共振谱的谱宽大于200ppm，导致谱色散变宽。13C NMR波谱在分子鉴定和结构解释方面具有特别的信息。然而，13C 核的天然丰度低（1.1%）和低灵敏度阻碍了该同位素在核磁共振代谢组学中的应用。为了增强13C NMR信号，人们开发了不同的NMR方法。例如，极化转移无失真增强（DEPT）是提高NMR谱灵敏度的一种有效手段，利用DEPT可以将13C信号强度提高4倍。DEPT核磁共振实验也有助于区分CH2和（CH，CH3），例如DEPT-135的13C NMR谱产生负强度的CH2峰和正强度的CH和CH3峰（下图）。 15NNMR谱在结构生物学中非常有用，包括蛋白质、RNA、DNA结构和动力学的研究，以及蛋白质-金属配位、蛋白质-蛋白质和蛋白质-配体相互作用的研究。然而，由于15N的自然丰度较低，只有0.37%和较低的敏感性，这一方法在代谢组学研究中的应用前景不大。 2.1.3 二维（2D）核磁共振波谱 二维（2D）核磁共振波谱可以用来克服质子1D核磁共振波谱中重叠共振的问题，从而比1D方法能够检测和比对更多的代谢物。二维核磁共振波谱是基于空间自旋耦合或键耦合，前者主要用于结构解释，后者用于分子鉴定。 通过键相关，核磁共振谱分为两大类：同核谱，主要是（1H-1H）如相关谱（COSY）和全相关谱（TOCSY），异核谱（1H-13C）。 其他二维方法，如二维J分辨NMR谱（J-Res）和扩散有序谱（DOSY）已用于基于NMR的代谢组学研究。采用COSY和DOSY相结合的方法，研究了肌营养不良小鼠模型心肌组织的代谢变化。包括单量子相干（HSQC）、异核多量子关联（HMQC）和异核多键关联（HMBC）的异核二维实验在二维上具有较高的分辨率，主要使用（13C），并被用于代谢产物的识别和鉴定。 尽管二维核磁共振实验改善了核磁共振信号的分散性，但增加的采集时间、数据大小和数据分析的复杂性，限制了这种方法的频繁使用。然而，核磁共振仪器的不断发展和新的更快的核磁共振信号采集和数据处理方法正导致代谢组学研究中更多地使用二维技术。 2.1.4 相关光谱学（COSY） COSY是二维同核相关光谱的第一项技术，多年来被用于分子鉴定和结构解释。COSY在代谢组学研究中得到了应用，因为它得益于相对较短的实验时间，可以在几分钟内运行2D谱，提供的信息比从1DNMR谱获得的信息多得多。 最简单的COSY脉冲序列包括一个90°RF脉冲，然后是演化时间（t1），然后是第二个90°脉冲，最后是测量周期（t2）。COSY谱主要由同核（1H-1H）相关谱组成，其中2D谱中的交叉峰通过核对之间的键耦合来指示。 交叉峰是通过两核间的键磁化传递来表示的。这为鉴定由许多分子组成的样品中属于同一分子的峰提供了强有力的工具，生物样品中的代谢物也是如此。由于通过键关联只发生在同一分子内，COSY核磁共振谱已被广泛应用于基于核磁共振的代谢组学应用中。 上图显示了二维COSY核磁共振谱，耦合质子之间的相关性可用于分配核磁共振信号和识别相应的分子。然而，对于多个重叠信号，2DCOSY不够强大，不允许分配单个信号。其他二维核磁共振实验，如全相关谱（TOCSY），可用于辅助信号分配。 2.1.5 总相关光谱学（TCOSY） TOCSY或HOHAHA（同核Hartmann-Hahn）是COSY的一种类似方法，其中给定核的化学位移（如H）与原子自旋系统（未断开的耦合链）中相同化合物的其他Hs的化学位移相关。与COSY相似，COSY能观察到相邻碳原子中通过标量耦合连接的原子对（质子）之间的相互关系，TOCSY能谱不仅显示了直接耦合的质子的交叉峰，也显示了通过耦合链连接的质子的交叉峰。 例如，如果质子A与质子B耦合，质子B与质子C耦合，COSY谱只表示A与B的耦合，而TOCSY谱则显示A与B和C的耦合。 下图显示了TOCSY（蓝色）和COSY谱（红色）的叠加图：可以观察到更多的蓝色峰，它们代表与同一分子（正丙醇和正丁醇）相关的质子信号耦合的每个质子信号。这表明TOCSY谱可以用来分辨属于不同分子的重叠峰。 下图示出了上页图的扩展区域。很明显，正丙醇峰可以通过简单地检测共享四个互相关峰（正丁醇，绿色箭头）的信号与仅共享三个互相关峰（正丙醇，黑色箭头）的信号进行分辨。通过在绘图轴上绘制从交叉峰到1D光谱的投影来完成峰值的比对（下图）。将绿色箭头（丁醇）与3.584ppm处的信号相连的箭头投影证实了该峰值指的是丁醇，而不是丙醇；将1.564ppm处的信号与黑色箭头相关联的第二个投影证实了该峰值对应于丙醇分子（下图）。确认一个峰为丙醇，另一个峰为丁醇，就足以利用TOCSY谱完成两个分子的所有信号比对（下图）。1H NMR信号的分配可与其它2DNMR技术相结合，如异核相关谱。这将有助于分配其他核信号，如碳核磁共振谱。 2.1.6 异核单量子相关光谱（HSQC） 键关联也可用于两种不同类型的原子核（通常为1H，13C或15N）之间的关联，这两种原子核由一个键分离。例如，1H-13C的HSQC光谱协调了质子和相应的结合碳的化学位移，因此每对耦合原子只能获得一个交叉峰。因此，HSQC为信号比对，特别是重叠质子信号的比对提供了一种特别有用的方法。 下图显示了CDCL3中正丁醇和正丙醇混合物的1H-13CHSQC光谱。结果表明，HSQC在解决重叠质子信号方面是有效的。例如，扩展区（A）在0.91ppm处分辨重叠的质子信号。此外，HSQC谱可用于质子和碳核磁共振谱的归属。 HSQC也是一种减少低灵敏度和低自然丰度原子核（如13C和15N）实验时间的有效技术，而从较敏感的原子核I（通常1h）转移到较不敏感的原子核（如13C和15N）的磁化强度是最重要的技术之一，在蛋白质信号比对中常用的实验技术，由于核磁共振信号的比对是研究蛋白质结构和动力学的前提。二维多量子关联谱（HMQC）是一种类似于HSQC谱的二维异核相关NMR方法，它提供的信息与HSQC谱相同，但使用的方法不同。HSQC和HMQC都被用于基于NMR的代谢组学研究，HSQC被认为在大分子如蛋白质方面更为优越。 异核多键相关（HMBC）是一种二维异核相关技术，它将两种不同类型的原子核（即13C和1H）的化学位移联系起来，这些原子核被两个或多个化学键分开。 一个核的化学位移，如1H，通常在直接测量的维度（F2）中检测到，另一个核的化学位移，如13C（X-核或异核）在间接维度中记录，如图所示。 在这种方法中，使用低通滤波来消除与单键相互作用相对应的单键关联，即所谓的“单量子相干”。例如，（1H–13C）HMBC消除了单一的C–H键关联，同时将H与C的化学位移关联起来，当H与C被两个或三个键分离时，在某些情况下，甚至与更遥远的键分离时。因此，（1H-13C）HMBC通常用于比对季碳和羰基化合物的信号。 HMBC与HSQC或HMQC的结合为信号的比对提供了一种强有力的方法。下图显示了HMQC（红色）和HMBC（蓝色），七个红色交叉峰与正丙醇和正丁醇中的七个碳有关，十六个蓝色交叉峰与长键相关相互作用有关。该图展示了结合和整合二维核磁共振实验信息进行光谱分配的能力。HMQC谱可用于区分重叠信号和分离信号。 例如，在0.92ppm左右观察到的质子多重波信号与10.07和13.79ppm处的两个碳峰相耦合，证实质子核磁共振信号确实是两个重叠的信号。类似地，约1.55ppm的质子倍增与两个碳信号耦合，而1.37、3.54和3.58ppm的剩余质子信号中的每一个仅与一个碳信号耦合。 此外，HMBC和HSQC光谱可用于正丁醇和正丙醇的分离和分配。例如，连接25.67ppm的碳信号和1.564的质子共振的碳HSQC交叉峰（红色）与两个HMBC交叉峰（黑色箭头）对齐，因此，将三个峰分配给正丙醇分子，而HSQC（红色）与另外三个蓝色HMBC交叉峰对齐，将这些峰分配给正丁醇分子（绿色箭头；见下图）。 下图展示了正丁醇化学键连接的示例模型，该模型可以通过二维实验对同核关联和异核关联进行研究。 2.2 质谱（MS） 质谱（MS）是主要用于鉴定未知化合物和量化样品中的已知分子。至于核磁共振和X射线，它也可用于结构解释和研究所研究材料的化学性质。由于其高灵敏度和高选择性，为生物样品等混合样品中代谢物的分析提供了重要的分析平台。此外，质谱还可以检测不含质子或碳的离子，如金属离子。然而，没有一种MS方法适合于检测所有种类的代谢产物，因此必须使用一种以上的方法进行全面的代谢谱分析。 质谱仪具有不同的电离源和可用于检测不同种类分子的质谱分析仪。例如，使用GC-MS的优点包括高分离效率和可重复的保留时间，可在不同实验室之间交换，以使用保留时间作为标记的保留指数概念进行数据比较。 然而，GC-MS固有的局限性在于它只检测挥发性化合物或可衍生成挥发性的化合物。 此外，MS不能检测到所有的代谢物，因为有些代谢物不能用某些电离方法电离。 MS检测器的动态范围仍然只有3-4个数量级，而代谢产物浓度的动态范围通常要大得多，没有一种检测器能够检测出所有的代谢产物。在生物样品的代谢验证中，一个普遍的挑战是许多代谢物尚未完全鉴定。 质谱法能检测到的代谢物的数量和种类取决于电离模式的选择。没有一种单一的电离方法可以涵盖所有的代谢物类别，如极性、非极性中性和离子性。因此，应独立使用不同的电离方法，以最大限度地增加检测到的代谢物数量。 例如，在LC-MS分析中，正模式的电喷雾电离（ESI）是最常见的模式，可以有效地电离大范围的中型极性分子，而负电离模式对于某些代谢物类别（如碳水化合物和有机酸）更为强大。 据报道，大气压化学电离（APCI）和电喷雾电离（ESI）都能使红细胞代谢组的覆盖率增加34%。 据报道，通过使用一套不同的GC-MS和LC-MS互补方法，可在血液样本的定向分析方法中检测多达100–500种代谢物，并可在指纹模式中检测约600–1000种代谢物。 需要注意的是，LC-MS和GC-MS中的代谢产物鉴定策略不同，通常只检测分子离子，需要额外的MS/MS实验来获得代谢产物的特性和结构信息。 2.2.1 液相色谱-质谱（LC-MS） LC-MS包括两种强大的分析工具：高效液相色谱法（高效液相色谱法，简称高压液相色谱法）和质谱法。当组合时，LC-MS用于分离、鉴定和定量混合样品中的分子。 高效液相色谱技术首先根据分子大小、电荷、极性和对其他分子的依附性等不同的物理和化学性质来分离分子。至于其他色谱技术，高效液相色谱由固定相和流动相组成。 固定相包括使用硅胶等材料，这些材料根据分子大小在不同程度上减缓分子的移动，从而允许根据大小差异分离分子。 流动相包括含有样品混合物的溶液，并通过分子分离发生的固定相（色谱柱）。 柱层析法可用于从混合物中纯化单个化合物。不同的样品需要不同的色谱柱、蛋白质和肽样品，例如，需要不同的色谱柱，不同于代谢组学研究中典型的小分子样品所需的色谱柱。一旦分析物被分离，它们就会通过质谱分析仪，在那里根据质荷比进行检测，每条合成线的强度对应于每个分子的相对浓度。 液相色谱-质谱联用技术以其分离和检测多种分子的能力，可能是应用最广泛的质谱技术，特别是在生物科学中。LC-MS是进行大多数代谢物分析研究的一种非常适用的工具，可以获得高灵敏度的定量和结构信息。不同的分离方法可以用来分离不同种类的代谢物。 反相梯度色谱法（RP）已成为LC-MS研究中最常用的用于全局代谢产物分析的分离方法。然而，这不是极性和/或离子物种的最合适方法，其中包括许多重要的代谢物（有机酸或氨基酸）。这些代谢物是生化途径中非常重要的组成部分，它们的评价可能对检测关键代谢状态，如先天性代谢错误和代谢综合征有重要意义。 亲水相互作用色谱法（HILIC）是一种可用于极性代谢物离子化的方法，可增加代谢物检测的广度。为了最大限度地覆盖代谢物，可以对样品进行两次分析，要么分别使用RP和HILIC，要么在HILIC和RP-LC的“正交”组合中使用二维分析的柱切换方法。尽管RP和HILIC联合使用是许多代谢物的首选电离方法，但这种方法并不涵盖生物样品（如尿液）代谢物极性的整个范围。 因此，建议采用其他电离方法，如正、负电喷雾电离（ESI）模式和大气压化学电离（APCI），以便最大限度地检测生物样品中的不同代谢物。考虑到所有这些可能性，需要以八种不同模式（八次独立运行）进行分析，以全面分析代谢物。这些组合拓宽了LC-MS在代谢组学中的应用，事实上，无论是靶向代谢组学分析还是非靶向代谢组学分析，都越来越多地使用不同的LC-MS方法进行。 2.2.2 气相色谱-质谱 GC-MS GC-MS是一种新的分析挥发性分子的工具，由于现代毛细管气相色谱具有高分辨率和可重复性的色谱分离，这些特点使其非常适合复杂代谢混合物的分析。与LC-MS类似，GC-MS由气相色谱和质谱两种强大的分析方法组成。这些方法共同提供了一种最强大的分离方法，可用于提供挥发性化合物的定性和定量信息。 样品首先通过气相色谱仪，在气相色谱仪中对混合物中的挥发性有机化合物进行高分辨率分离。气相色谱装置主要由色谱柱组成，基本上是一个长度从小于2米到60米或以上不等的管，直径从10厘米到30厘米不等。 不同类型的色谱柱，如填充柱和毛细管柱，用于分离不同类型的样品。填充管可以是不锈钢、玻璃或熔融石英制成，通常以线圈的形式形成，以便在大约250℃的温度下放入高温实验用的烘箱中。惰性气体（如氦气）吹过色谱柱；当样品进入色谱柱时，它蒸发了，挥发性分子被氦推动穿过柱。一开始，所有的分子一起移动，但根据分子量和大小，其中某些分子的移动速度比其他分子慢。较小的分子比较大的分子移动得更快，当它们通过色谱柱时，分子继续彼此分离，最终以不同的组分形式从色谱柱中出现，从而提供了一种有效的分离方法。 当分子离开气相色谱柱时，它们被引入质谱，在那里用电离方法（如电子束）电离。由特定分子形成的离子将取决于该分子的性质，并且该分子的电离分子和离子片段都可用于根据质荷比在分子水平上区分和识别混合物的组分。此外，可以通过测量峰的绝对强度来获得关于混合物成分的定性信息，其中最高峰被取为表示100%丰度，并用作其他峰的参考。 因此，GC-MS是分析挥发性代谢物的首选分析工具，已被用于代谢组学研究的不同领域，包括植物代谢组学和筛选先天代谢错误。 除了建立良好的数据库，如费恩（Fiehn）代谢组学库，GC-MS提供了良好的重现性和高度可重复的片段，因此为鉴定代谢物提供了有力的工具。其他优点包括高灵敏度和分辨率、低成本和易于使用的仪器。气相色谱-质谱分析的主要局限性在于仅限于小分子挥发性物质，这意味着该方法在全球代谢谱研究中的应用有限。 气相色谱-质谱分析的主要局限性在于仅限于小分子挥发性物质，这意味着该方法在全球代谢谱研究中的应用有限。再者，生物样品的制备，如生物体液，可能会耗费时间和重复性，这可能会导致实验误差。在电离过程中，可能会出现其他问题，如产物的形成和降解。此外，在衍生化反应中，非挥发性代谢物可以转化为不同形式的衍生物，产生碎片，从而使同一母体代谢物的不同形式共存。在分析代谢物含量具有高度可变性的真实样品（如人类尿液）时，根据代谢物的不同性质，衍生化可能以不同的转化率发生，因此潜在地显著影响再现性和总体结果。为了克服诸如不精确量化的问题，标准化合物可用于衍生标准化合物和数据校正过程，例如标准化。 为了产生可重复的质谱和高度可转移的EI-MS谱库，建议使用70ev的标准MS电子电离能，以便通过质谱库匹配（如NIST和FiehnLib）识别化合物。  图片9.jpg |
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