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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 救命啊！大片段引物扩增（参考megawhop的方法）
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桧h桧桧

新虫 (初入文坛)

[求助] 救命啊！大片段引物扩增（参考megawhop的方法） 已有1人参与

一开始可以p出完整的质粒，但是胶孔处有很亮的条带跑不下来并且拖带严重。结果现在不管怎么试都p出目的条带了，要不全是拖带，要不只能看到p出大片段引物的条带
晕，有没有同学可以交流交流

救命啊！大片段引物扩增（参考megawhop的方法）


救命啊！大片段引物扩增（参考megawhop的方法）-1


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1楼 2020-07-12 15:04:22
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香园白丁

金虫 (小有名气)
你可以试着分段P，然后拿overlap连起来

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2楼2020-07-12 15:31:04
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雨独步

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
桧h桧桧: 金币+10, ★★★很有帮助 2020-07-13 11:02:36
做引物的大片段没有问题的话，换一管模板质粒试试吧，另外质粒浓度要准确，我们一般不超过30ng，加多了DpnI不好切。
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3楼2020-07-12 19:00:49
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hanxiaominhu

至尊木虫 (著名写手)
不知道你的片段有多大，质粒当模板的话，至少得稀释个几百几千倍。

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4楼2020-07-13 08:09:48
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嘉木余香

新虫 (初入文坛)
我也是，质粒之前也是能扩增出来，现在同样的条件又不能了。

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5楼2021-02-23 16:05:15
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915191677

金虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★
渊博震天: 金币+5, 鼓励积极应助回帖 2021-03-20 19:44:52
第一种情况，留在胶孔不出来，很可能是交联在一起了，在跑胶加孔之前，95℃ 5min加热变性，缓慢降温，然后后进行跑胶即可。

第二种情况，后面扩增不出来，考虑是否DNA分解，重新提取质粒。加入质粒之前测一下浓度，质粒的拷贝数一般不宜过高，模板过高也会抑制反应。 此外，长片段扩增可以尝试其他酶试试，比如takara GXL。
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6楼2021-03-17 15:06:28
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