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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 重组质粒经诱导剂表达后是不是就会持续表达？
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神农使者

金虫 (正式写手)

[求助] 重组质粒经诱导剂表达后是不是就会持续表达？ 已有1人参与

有一个基因缺失型工程菌，需要转入外源基因表达，想问下，质粒成功转进去的菌株经诱导表达后是不是就会持续表达。后面几次培养不加诱导剂是不是也会生长？
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1楼 2020-07-10 10:58:36
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forhighbio

捐助贵宾 (著名写手)
启动子是阿拉伯糖操纵子，调控不严格，有渗漏表达

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4楼2020-07-11 07:33:35
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雨独步

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
神农使者: 金币+5, ★★★很有帮助 2020-07-12 01:27:53
引用回帖:
3楼: Originally posted by 神农使者 at 2020-07-10 15:10:04
谢谢回复。我这边就是质粒转进去后，需要加阿拉伯糖诱导表达，然后菌种可以生长，正常不加的话，基因不表达，菌种是不生长的。刚转进去后，是只有加了诱导剂后才生长，可后面培养了几次发现不加阿拉伯糖也能生长。 ...

阿拉伯糖启动子的渗漏相对已经很低了，渗漏是否足以支持菌株生长，试一下就知道。另外，你后面培养不诱导也能生长可能是你诱导的那个蛋白半衰期较长，已经表达的蛋白还能存在很长时间，如果是这种情况，某些情况下会考虑在该蛋白后面加上降解标签。这都是我个人见解，仅供参考。
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5楼2020-07-11 08:43:15
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雨独步

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
神农使者: 金币+5, ★★★很有帮助 2020-07-10 21:52:20
不是这样的，我不太清楚你后几次培养是什么操作，转接新的培养基或者新的平板还是要加诱导剂，诱导剂不会随着菌株永远存在的，何况诱导剂和调控蛋白的结合与解离本就是一个动态平衡。
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2楼2020-07-10 14:34:10
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神农使者

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 雨独步 at 2020-07-10 00:34:10
不是这样的，我不太清楚你后几次培养是什么操作，转接新的培养基或者新的平板还是要加诱导剂，诱导剂不会随着菌株永远存在的，何况诱导剂和调控蛋白的结合与解离本就是一个动态平衡。

谢谢回复。我这边就是质粒转进去后，需要加阿拉伯糖诱导表达，然后菌种可以生长，正常不加的话，基因不表达，菌种是不生长的。刚转进去后，是只有加了诱导剂后才生长，可后面培养了几次发现不加阿拉伯糖也能生长。就是疑问是不是在诱导剂的板子上经诱导后就能持续表达了。问过一个师兄，他说这种情况是提前诱导了，需要让诱导消失，才能重新进行后续的诱导表达实验，否则实验不准确。就是不清楚怎么才能让给诱导消失，还是最好重新转化一次。
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3楼2020-07-10 15:10:04
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神农使者

金虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 雨独步 at 2020-07-10 18:43:15
阿拉伯糖启动子的渗漏相对已经很低了，渗漏是否足以支持菌株生长，试一下就知道。另外，你后面培养不诱导也能生长可能是你诱导的那个蛋白半衰期较长，已经表达的蛋白还能存在很长时间，如果是这种情况，某些情况下 ...

谢谢。现在只想知道这个重组菌是不是没用了，因为后面要做的是蛋白抗性筛选，这种持续表达不是很难做后续了吗。还有想请问下降解标签一般有哪些。
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6楼2020-07-12 01:29:38
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神农使者

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by forhighbio at 2020-07-10 17:33:35
启动子是阿拉伯糖操纵子，调控不严格，有渗漏表达

我也感觉是有本底表达，而且表达量还挺高，现在我这个重组菌在纯amp的板子上长的跟加了阿拉伯糖生长差不多了。理论上纯amp的板子应该是不长的，现在有点慌，不知道该怎么弄了。
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7楼2020-07-12 02:20:38
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雨独步

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 神农使者 at 2020-07-12 01:29:38
谢谢。现在只想知道这个重组菌是不是没用了，因为后面要做的是蛋白抗性筛选，这种持续表达不是很难做后续了吗。还有想请问下降解标签一般有哪些。...

大肠杆菌中常用的降解标签有LAA和ssrA，也有研究者对这些tag的氨基酸进行不同程度改变，衍生出一系列降解特性各有差异的tag。
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8楼2020-07-12 09:06:18
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forhighbio

捐助贵宾 (著名写手)
另外你缺陷的这个基因是不是不是致死突变。

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9楼2020-07-12 10:11:43
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神农使者

金虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by forhighbio at 2020-07-11 20:11:43
另外你缺陷的这个基因是不是不是致死突变。

我这个工程菌缺失的基因是代谢酶基因，这个菌株是在普通LB板子上不生长，正常培养需要额外添加外源蛋白。现在我是在做同源基因的原核表达，一是看目的基因表达后能否在正常板子上生长，再一看是看表达量。现在转化后能生长，但是表达量有点控制不住，感觉实验出问题了

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10楼2020-07-12 13:06:22
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