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小鼠MEF细胞诱导分化遇到问题！
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各位老师好，这是我第一次发帖！请多多关注！ 本人最近在做小鼠MEF原代，感染病毒诱导分化的实验。我自己通过酶消化法制作了小鼠MEF原代细胞P0，六孔板提前铺明胶，通过慢病毒感染转录因子进行诱导1-5天，后2天换一次液。但是在大约2周-3周开始，六孔板中的MEF细胞就开始成片的脱落了（如图），因为培养很久长得非常密，形成了一个圆片形的细胞片，从周围开始剥脱。我自己做的人原代FB细胞未出现过这样的问题（边缘也会少许剥脱，但细胞正常）。我考虑是MEF细胞死亡后成片脱落，而不是贴壁不好导致的死亡。因为如果把诱导培养14天左右的MEF消化后传代，发现细胞已经全部死亡，没有能贴壁的。另外，我这批MEF冻存再复苏时会发现大量细胞死亡，但活下来的细胞长的还不错，如图所示。且这批原代MEF细胞形态规则、清晰，生长状态良好，增殖活力很强。 我目前自己的考虑是原代细胞的问题，因为很多文献都有写MEF诱导培养2周-4周的情况，而我病毒感染后的MEF未出现异常，表达也OK，该有的puro抗性筛选也很好，但是在长期培养后，细胞越来越密后出现了死亡（每天都观察细胞，培养基变黄就会提前换液，且未发现污染的情况）。  在此想请教有经验的老师同学，你们有出现这样的情况吗?原因是什么？该怎么避免呢？因为我的诱导时间至少要持续2周，甚至最长会到1个月。  WeChat Image_20200610142334.jpg  图像_660.jpg  图像_661.jpg |
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