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科研人必做实验之EMSA
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EMSA又称作凝胶迁移实验，这是每个实验者的必做实验啊！是一种用于蛋白与核算相互作用的技术。最初是用于转录因子与启动子相互作用的验证性实验，也可应用与蛋白-DNA、蛋白-RNA互作研究。 实验目的： 凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA）可以：（1）研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用；（2）可用于DNA定性和定量分析；（3）用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。 实验过程： 一、样品的制备：包括探针的标记准备，探针的纯化和凝胶的制备 1、探针的标记准备： （1）如下设置探针标记的反应体系：总体积 10微升 待标记探针 （1.75pmol/微升） 2微升 T4 Polynucleotide Kinase Buffer （10X） 1微升 Nuclease-Free Water 5微升 [γ-32P]ATP（3,000Ci/mmol at 10mCi/ml） 1微升 T4 Polynucleotide Kinase （5-10U/微升） 1微升 按照上述反应体系依次加入各种试剂，加入同位素后，Vortex混匀，再加入T4 Polynucleotide Kinase，混匀。 （2） 使用水浴或PCR仪，37℃反应10分钟。 （3） 加入1微升探针标记终止液，混匀，终止探针标记反应。 （4） 再加入89微升TE,混匀。此时可以取少量探针用于检测标记的效率。通常标记的效率在30%以上，即总放射性的30%以上标 记到了探针上。为实验简便起见，通常不必测定探针的标记效率。 （5） 标记好的探针最好立即使用，最长使用时间一般不宜超过3天。标记好的探针可以保存在-20℃。 二、探针的纯化： 通常为实验简便起见，可以不必纯化标记好的探针。在有些时候，纯化后的探针会改善EMSA的电泳结果。如需纯化，可以按照如 下步骤操作： （1） 对于100微升标记好的探针，加入1/4体积即25微升的5M醋酸铵，再加入2体积即200微升的无水乙醇，混匀。 （2） 在-70℃至-80℃沉淀1小时，或在-20℃沉淀过夜。 （3） 在4℃，12000g-16000g离心30分钟。小心去除上清，切不可触及沉。 （4） 在4℃，12000g-16000g离心1分钟。小心吸去残余液体。微晾干沉淀，但不宜过分干燥。 （5） 加入100微升TE，完全溶解沉淀。标记好的探针最好立即使用，最长使用时间一般不宜超过3天。标记好的探针可以保存于-20℃。 三、凝胶的制备： （1） 制备6.5%非变性聚丙烯酰胺凝胶：（注意根据试剂情况按比例调整总体积） 5XTBE 1ml 30%Acrylamide/Bis 2.2ml deionized,sterilewater 6.62ml 80%Glycerol（甘油） 80μl 10%AP（硫酸氨） 90μl TEMED（四甲基乙二氨） 10μl 总体积 10ml （2）按标准步骤制备凝胶。 （3）加样前先在预冷的0.5X TBE buffer中120V预电泳10min，与电泳完毕后冲洗加样孔。 （4）混合样本及电泳缓冲液，点样电泳。 （5）将电泳槽置于冰上或者4℃环境中，恒压100V进行电泳，直至缓冲液指示带距离凝胶底部2~3cm为止。（大约50-60min，根据实际情况调整电泳时间及电压；电泳时间不宜过长） EMSA的结合： 1、设置如下EMSA结合反应 阴性对照反应： （1）Nuclease-Free Water ：7微升。 （2）EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) ：2微升。 （3）细胞核蛋白或纯化的转录因子： 0微升。 （4）标记好的探针 ：1微升。 （5）总体积 ：10微升。 样品反应： （1）Nuclease-Free Water ：5微升。 （2）EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) ：2微升。 （3）细胞核蛋白或纯化的转录因子 ：2微升。 （4）标记好的探针： 1微升。 （5）总体积： 10微升。 探针冷竞争反应： （1）Nuclease-Free Water ：4微升。 （2）EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) ：2微升。 （3）细胞核蛋白或纯化的转录因子： 2微升。 （4）未标记的探针： 1微升。 （5）标记好的探针： 1微升。 （6）总体积 ：10微升。 突变探针的冷竞争反应： （1）Nuclease-Free Water ：4微升。 （2）EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) ：2微升。 （3）细胞核蛋白或纯化的转录因子 ：2微升。 （4）未标记的突变探针： 1微升。 （5）标记好的探针： 1微升。 （6）体积 ：10微升。 Super-shift反应： （1）Nuclease-Free Water：4微升。 （2）EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) ：2微升。 （3）细胞核蛋白或纯化的转录因子：2微升。 （4）目的蛋白特异抗体 ：1微升。 （5）标记好的探针：1微升。 （6）总体积 ：10微升。 2、加入标记好的探针前先混匀，并且室温 （20～25 ℃） 放置 10 分钟，从而消除可能发生的探针和蛋白的非特异性结合，或让冷探针优先反应。然后加入标记好的探针，混匀，室温放置 20 分钟。 3、加入1微升EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(无色，10X)，混匀后立即上样。 电泳分析： 1、用0.5XTBE作为电泳液。按照10V/厘米的电压预电泳10分钟。预电泳的时候如果有空余的上样孔，可以加入少量稀释好的1X 的EMSA上样缓冲液(蓝色)，以观察电压是否正常进行。 2、把混合了上样缓冲液的样品加入到上样孔内。在多余的某个上样孔内加入10微升稀释好的1X的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液 (蓝色)，用于观察电泳进行的情况。 3、按照10 V/厘米的电压电泳。确保胶的温度不超过30℃，如果温度升高，需要适当降低电压。电泳至EMSA/Gel-Shift上样缓 冲液中的蓝色染料溴酚蓝至胶的下缘1/4处，停止电泳。 4、剪一片大小和EMSA胶大小相近或略大的比较厚实的滤纸。小心取下夹有EMSA胶的胶板，用吸水纸或普通草纸大致擦干胶板边 缘的电压液。小心打开两块胶板中的上面一块(注：通常选择先移走硅烷化的那块玻璃板)，把滤纸从EMSA胶的一侧逐渐覆盖住整个EMSA胶，轻轻把滤纸和胶压紧。滤纸被胶微微浸湿后(大约不足1分钟)，轻轻揭起滤纸，这时EMSA胶会被滤纸一起揭起来。把滤纸侧向下，放平，在EMSA胶的上面覆盖一层保鲜膜，确保保鲜膜和胶之间没有气泡。 5、 干胶仪器上干燥EMSA胶。然后用X光片压片检测，或用其它适当仪器设备检测。 |
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