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stella0xhx

新虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
引物特异性不好,升高点温度,循环次数多点看,重新设计一下引物吧
11楼2009-07-12 09:50:21
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witch-dj

木虫 (著名写手)

快乐家族-witchdj

退火温度进行一下调整
查一下引物特异性吧
12楼2009-07-12 22:21:16
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fyn512045

新虫 (初入文坛)

谢谢各位了

我的上样量是20微升,退货温度间隔也很大,在四五度左右,有的话各个梯度都有,没有的话都没有,我现在想是不是酶的问题,我25微升体系,加大概0.5微升酶。
13楼2009-07-13 10:23:39
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ly888lsp

木虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
原因:

(1)引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。(2)Mg2+离子浓度过高、退火温度过低,及PCR循环次数过多有关。(3)酶的质和量,往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现,酶量过多有时也会出现非特异性扩增。

对策:①必要时重新设计引物。②减低酶量或调换另一来源的酶。③降低引物量,适当增加模板量,减少循环次数。④适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性,65℃左右退火与延伸)。⑤降低Mg2+浓度。
14楼2009-07-15 09:50:14
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lihuanzheng

铜虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
是不是你加样的时候,上每个体系的酶由于枪头沾有,体系不准确
第二就是是不是你提的DNA酒精过高,这样也会影响扩增的
第三就可能是你的引物设计特异性不好
你可以降低下温度看看
15楼2009-07-18 10:38:24
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lihuanzheng

铜虫 (正式写手)

最好用50微升的体系
建议采用Mix或者你上样前把每个体系反应液配好再分装
16楼2009-07-18 10:40:08
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smallcat227

木虫 (著名写手)

重新设计引物……
17楼2009-07-19 21:13:54
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syn1985

木虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
做一个温度梯度吧 温度不合适
或者适当提高点模板量
18楼2009-07-27 16:25:35
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hyde0706

木虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
首先,你的模板质量如何,这对PCR是最关键的。其次,引物设计的有没有问题,序列分析怎么样。PCR程序怎么样,退火温度的考察很关键。
19楼2009-07-28 11:00:21
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695

木虫 (职业作家)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
建议设置温度梯度,筛选合适的扩增温度,祝楼主顺利
20楼2009-07-28 16:59:04
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