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lyq123456新虫 (正式写手)
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[求助]
求助有关异二聚体蛋白构建纯化问题 已有2人参与
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我想纯化一个细胞因子的两个受体亚基的异二聚体蛋白，但是不清楚是不是用linker连接就可以？或者用多长的linker才不会影响两个受体蛋白的表达和正常折叠？有前辈有比较好的构建纯化这种异二聚体的经验和方法吗？求赐教！！！ 发自小木虫IOS客户端 |
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pennchem
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2楼2020-05-30 19:56:17
zsygxh
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【答案】应助回帖
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没有同时表达过异源二聚体，说说个人的想法 首先用linker连接是不行的，因为这样表达出来就是一个蛋白而不是两个亚基了，肯定影响折叠。 想到的方法： 1. 质粒共转化：将两个亚基分别连入两个不同的质粒，共同转化表达，注意选用双抗性进行筛选 2. 多顺反子表达：在同一个质粒的启动子-终止子之间插入两个亚基的基因，并各自带RBS、起始密码子和终止密码子，这样转录出一条mRNA，在这条mRNA上有两个RBS，分别结合核糖体翻译两个蛋白。这个可以自己构建，也有商业化载体pETDuet。 3. 分别表达纯化两个蛋白，获得各自的单体，体外优化条件进行孵育，有相互作用，亚基结合，再用分子筛分离纯化去除没结合的单体。若表达纯化的单体不稳定，可以分别用尿素或盐酸胍加还原剂进行变性处理，再按等摩尔比混合，之后尝试复性，再纯化分离出正确折叠的二聚体。 |
3楼2020-06-12 16:53:17
liudayeye
木虫 (正式写手)
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4楼2021-07-21 12:04:34