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朱静zz

新虫 (初入文坛)

[求助] 有关mix组分对高浓度模板的扩增影响,,求大神解答 已有2人参与

自己配置的pcr mix,做了模板浓度梯度进行扩增,其他梯度效果就很好,高浓度的就不好,在不加rox的机器上只是高浓度模板的平台期低,加rox的机器上高浓度模板直接扩不出来是因为什么呀,是mix里什么成分影响吗?这个高浓度模板其实也不是很浓,ct16左右。。。
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biosci

捐助贵宾 (职业作家)


2楼2020-05-27 11:12:09
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soarshining

捐助贵宾 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
推测你说的高浓度模板,不是通过梯度增加RNA然后在相同体系下反转,而是用反转的cDNA母液进行梯度稀释得到的。而反转体系里面有一些东西对后面的定量PCR反应是有影响的,比如改变了离子浓度、甘油浓度等等。因此cDNA母液一般都需要稀释到1/3~1/4才行。
3楼2020-05-27 22:24:59
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朱静zz

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by biosci at 2020-05-27 11:12:09
加甜菜碱了吗

目前没有加,但之前测试mix组分的时候加过,没有改善就放弃了
4楼2020-06-03 17:02:29
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朱静zz

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by soarshining at 2020-05-27 22:24:59
推测你说的高浓度模板,不是通过梯度增加RNA然后在相同体系下反转,而是用反转的cDNA母液进行梯度稀释得到的。而反转体系里面有一些东西对后面的定量PCR反应是有影响的,比如改变了离子浓度、甘油浓度等等。因此cDN ...

母液是稀释了3倍之后进行浓度梯度测试的
5楼2020-06-03 17:04:37
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Liu19851225

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

楼主好,请问你模板浓度梯度最低是多少,我现在也想扩增不同浓度梯度的模板,但是不知道引物的量该加多少?
6楼2020-07-22 19:57:10
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