24小时热门版块排行榜    

查看: 1341  |  回复: 14
当前主题已经存档。

bingdong05

银虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
怀疑试剂盒的问题,最好换一个新的试剂盒或品牌试试,小片段不好回收的;还有一个可能的原因就是因为片段太小了,再加上回收过程中的造成的损失,可能电泳条带是有的但是看不到(以前碰到过这种情况,当时是75bp,用玻璃珠回收,电泳也是看不到,就根据marker的位置大体估计下条带如果有可能出现的位置,割胶,回收,链接,转化,最后发现得到目的转化子),建议楼主也碰下运气试试,因为条带在胶上的亮度除于浓度有关外,还与条带的大小有关,即同样浓度下,条带愈小,亮度愈暗。
11楼2009-07-10 15:37:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jlc0225

至尊木虫 (著名写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
我最近也回收不出来,可能是量太少了。
开始新的学习!
12楼2009-07-10 15:54:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ly888lsp

木虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
可能原因:

(1)模板:①模板中含有杂蛋白质;②模板中含有Taq酶抑制剂;③模板中蛋白质没有消化除净,特别是染色体中的组蛋白;④在提取制备模板时丢失过多,或吸入酚,模板本身拷贝数低;⑤模板核酸变性不彻底。

对策:纯化模板;配制有效而稳定的消化处理液,其程序亦应固定不宜随意更改;如果怀疑污染了抑制剂,可以使用乙醇沉淀DNA。

(2)酶失活

对策:需更换新酶,或新旧两种酶同时使用,以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。

(3)引物:引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称,是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题,两条引物一条浓度高,一条浓度低,造成低效率的不对称扩增,

对策:①选定一个好的引物合成单位;②引物的浓度不仅要看OD值,更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳,一定要有引物条带出现,而且两引物带的亮度应大体一致,如一条引物有条带,一条引物无条带,此时做PCR有可能失败,应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高,一条亮度低,在稀释引物时要平衡其浓度;③引物应高浓度小量分装保存,防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分,导致引物变质降解失效;④引物设计不合理,如引物长度不够引物之间形成二聚体等,需重新设计引物。

(4)Mg2+浓度:Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大,浓度过高可降低PCR扩增的特异性,浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。

对策:调整Mg2+浓度,从1mM到3mM,间隔0.5mM进行一系列反应,确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。注意:对实时定量PCR,使用3mM到5mM的镁离子浓度。

(5)反应体积的改变:通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul,应用多大体积进行PCR扩增,是根据科研和临床检测不同目的而设定,在做小体积如20ul 后,再做大体积时,一定要摸索条件,否则容易失败。

(6)物理原因:变性对PCR扩增来说相当重要,如变性温度低,变性时间短,极有可能出现假阴性;退火温度过低,可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。

对策:优化PCR温度,有时还有必要用标准的温度计,检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度。

(7)靶序列变异:如靶序列发生突变或缺失,影响引物与模板特异性结合,或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列,其PCR扩增是不会成功的。
13楼2009-07-15 22:18:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

thaw

铜虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
电泳
切胶
液氮速冻
磨碎
转至EP管加酚氯仿异戊醇
离心
取上清
弃中间层
再液氮冻

转至EP管加酚氯仿异戊醇
离心
取上清
弃中间层
再液氮冻

转至EP管加酚氯仿异戊醇
离心
取上清
把三管上清混一起加酚氯仿异戊醇
离心取上清
加异丙醇或乙醇沉淀
下面的就都会了吧
14楼2009-07-16 14:00:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

liby

铜虫 (初入文坛)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
片段太小的事,要么试试乙醇沉淀回收。
或者加Binding Buffer后37度多放会儿,洗脱时60度水浴20分,提高回收效率
15楼2009-07-16 17:11:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 sgba0307 的主题更新
普通表情 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 有时候,自然基金真的不能太认真 (我的申报经验) +9 majunge000 2026-08-11 11/550 2026-08-15 23:20 by botar
[基金申请] filecode=后面第一个是大写字母 +6 wangze12014 2026-08-14 7/350 2026-08-15 20:12 by gltch
[基金申请] 小木虫上这么多卖论文的,真有人买论文么?感觉没必要啊 +12 Tide man 2026-08-10 13/650 2026-08-15 16:34 by 氺木
[基金申请] 哪位老哥知道今年的国自然具体哪一天放榜? +7 Ldrop2023 2026-08-13 7/350 2026-08-15 15:57 by mzhh2000
[基金申请] 咱们一起用铁证分析2026国家社科基金中标与否 +7 启萌科技 2026-08-12 22/1100 2026-08-14 23:45 by Noways
[基金申请] 是这周出结果还是下周出结果? +4 yuleib84 2026-08-11 4/200 2026-08-14 23:05 by lfy8008
[基金申请] 应该是93bebmhtak前后十一个字符比较关键 +23 Lanmanbaby 2026-08-09 37/1850 2026-08-14 13:40 by Equinoxhua
[硕博家园] 请教兼职经验 +3 是阿文鸭 2026-08-09 3/150 2026-08-14 12:07 by HER12025
[基金申请] FileCode能看出啥? +10 要乐观耀哥 2026-08-10 32/1600 2026-08-14 09:37 by 要乐观耀哥
[基金申请] 我的国基提前知道中了,可是同事的操作让我实在接受不了,怎么会有这样的人 +10 家与远方 2026-08-10 15/750 2026-08-14 02:08 by 绵羊哥哥
[基金申请] 静等基金结果 +8 gjjjzhong 2026-08-10 21/1050 2026-08-13 17:56 by 且听虎啸
[基金申请] 重要来源:本周末出结果 +10 瞬息宇宙 2026-08-12 10/500 2026-08-13 15:46 by likettle
[基金申请] Filecode 又变了,巨变 +3 WH3796 2026-08-12 4/200 2026-08-13 14:13 by 小木虫6752397
[基金申请] 分享一下我之前已中青C的计划书的filecode +4 布布和一二 2026-08-11 5/250 2026-08-13 12:56 by cratir
[基金申请] 结合人工智能,周易传统文化,filecode打分制来了,3分以上希望很大。 +3 Tide man 2026-08-12 4/200 2026-08-13 08:35 by ZJTJZ
[基金申请] 综述论文作为代表作会不会影响评审专家的印象分? +11 yufeiwaner 2026-08-09 13/650 2026-08-12 08:17 by yufeiwaner
[基金申请] 帮忙看看fileCode +7 wwncly 2026-08-10 13/650 2026-08-11 19:36 by 冰心玉壶晴
[基金申请] 什么时候出结果,有咨询渠道??? +3 Tide man 2026-08-11 3/150 2026-08-11 17:54 by kudofaye
[基金申请] 确定了,国自然21号放榜 +6 布布和一二 2026-08-10 7/350 2026-08-10 19:15 by 2000zf36392
[基金申请] 据悉今年马上要出结果了 +7 瞬息宇宙 2026-08-10 8/400 2026-08-10 12:42 by Vivilian
信息提示
请填处理意见