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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » pcr产物回收后无条带
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bingdong05

银虫 (正式写手)
★
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怀疑试剂盒的问题，最好换一个新的试剂盒或品牌试试，小片段不好回收的；还有一个可能的原因就是因为片段太小了，再加上回收过程中的造成的损失，可能电泳条带是有的但是看不到（以前碰到过这种情况，当时是75bp，用玻璃珠回收，电泳也是看不到，就根据marker的位置大体估计下条带如果有可能出现的位置，割胶，回收，链接，转化，最后发现得到目的转化子），建议楼主也碰下运气试试，因为条带在胶上的亮度除于浓度有关外，还与条带的大小有关，即同样浓度下，条带愈小，亮度愈暗。
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11楼2009-07-10 15:37:01
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jlc0225

至尊木虫 (著名写手)
★
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我最近也回收不出来，可能是量太少了。
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开始新的学习！
12楼2009-07-10 15:54:25
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ly888lsp

木虫 (小有名气)
★
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可能原因：

（1）模板：①模板中含有杂蛋白质；②模板中含有Taq酶抑制剂；③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白；④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚，模板本身拷贝数低；⑤模板核酸变性不彻底。

对策：纯化模板；配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改；如果怀疑污染了抑制剂，可以使用乙醇沉淀DNA。

（2）酶失活

对策：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。

（3）引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，

对策：①选定一个好的引物合成单位；②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度；③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效；④引物设计不合理，如引物长度不够引物之间形成二聚体等，需重新设计引物。

（4）Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。

对策：调整Mg2+浓度，从1mM到3mM，间隔0.5mM进行一系列反应，确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。注意：对实时定量PCR，使用3mM到5mM的镁离子浓度。

（5）反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要摸索条件，否则容易失败。

（6）物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性；退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。

对策：优化PCR温度，有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度。

（7）靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。
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13楼2009-07-15 22:18:13
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thaw

铜虫 (小有名气)
★
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电泳
切胶
液氮速冻
磨碎
转至EP管加酚氯仿异戊醇
离心
取上清
弃中间层
再液氮冻
磨
转至EP管加酚氯仿异戊醇
离心
取上清
弃中间层
再液氮冻
磨
转至EP管加酚氯仿异戊醇
离心
取上清
把三管上清混一起加酚氯仿异戊醇
离心取上清
加异丙醇或乙醇沉淀
下面的就都会了吧
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14楼2009-07-16 14:00:17
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liby

铜虫 (初入文坛)
★
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片段太小的事，要么试试乙醇沉淀回收。
或者加Binding Buffer后37度多放会儿，洗脱时60度水浴20分，提高回收效率
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15楼2009-07-16 17:11:24
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