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艾柏森生物

铁虫 (小有名气)

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[交流] western blot实验步骤详解

一、实验步骤：
1、细胞总蛋白提取
1.1 对于悬浮细胞: 离心收集细胞，每106细胞加250 ul RIPA（在使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂），振荡。如果需要提高蛋白浓度，可以适当减少细胞总蛋白提取试剂体积。
1.2 对于贴壁细胞:
1.2.1 用TBS冲洗细胞2-3次。最后一次彻底吸干残留液。
1.2.2 加入适当体积的 RIPA（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂）于培养板、瓶内3-5min。期间反复晃动培养板、瓶，使试剂与细胞充分接触。
1.2.3 用细胞刮刀将细胞及试剂刮下，收集到1.5ml离心管中。
1.3 冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。
1.4 12000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。
2、组织蛋白提取：
2.1 组织块用冷TBS洗涤2-3次，去除血污，剪成小块置于匀浆器。加入10倍组织体积本试剂（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂）冰上彻底匀浆。如果需要提高蛋白浓度，可以适量减少该试剂体积。
2.2 将匀浆液转移至1.5ml离心管中，振荡。冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。
2.3 12000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。
3、蛋白浓度测定：BCA法侧蛋白浓度
4、 SDS-PAGE电泳
4.1 清洗玻璃板
4.2 灌胶与上样
4.2.1 将玻璃板对齐后放入夹中卡紧，操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。
4.2.2 按实验安排配制分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。大约45min后可倒去胶上层水并用吸水纸将剩余水吸干。
分离胶配比
分离胶浓度
试剂 8% 10% 12% 15% 18% 20% 8% 10% 12% 15% 18% 20%
H2O ml 4.63 4 3.3 2.3 1.3 0.63 6.9 5.9 4.9 3.4 1.9 0.9
30％丙烯酰胺（29：1） ml 2.67 3.3 4 5 6 6.67 4 5 6 7.5 9 10
1.5M TRIS－Hcl(PH 8.8) ml 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 3.8 3.8 3.8 3.8 3.8 3.8
10％SDS ml 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.15 0.15 0.15 0.15 0.15 0.15
AP ml 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.15 0.15 0.15 0.15 0.15 0.15
TEMED ul 5ul 5ul 5ul 5ul 5ul 5ul 7.5ul 7.5ul 7.5ul 7.5ul 7.5ul 7.5ul
总体积 ml 10ml 15ml
5%浓缩胶配比
试剂浓度 5%
H2O ml 2 3 4 6
30％丙烯酰胺（29：1）ml 0.5 0.75 1 1.5
1M TRIS－Hcl(PH 6.8)ml 0.5 0.75 1 1.5
10％SDS ul 40 60 80 120
AP ul 30 45 60 90
TEMED ul 4ul 6ul 8ul 12ul
总体积 ml 3ml 4.5ml 6ml 9ml

4.2.3 按前面方法配5%的浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。
4.3 加足够的电泳液后上样电泳。将样品加入电泳孔中，电泳。浓缩胶电压75V，分离胶用120V。电泳至溴酚蓝刚跑出即可终止电泳，进行转膜。
5 转膜（小于20kd的蛋白请使用0.22um的PVDF膜。）
5.1 准备6张7×225px的滤纸和一张大小适中的 PVDF膜，PVDF膜在使用之前要先用甲醇活化。
5.2 在加有转移液的盆里放入转膜用的夹子，两块海绵垫，一支玻棒，滤纸和经过活化的PVDF膜。
5.3 将夹子打开使黑的一面保持水平。在垫子上垫海绵、三层滤纸。
5.4 小心剥下分离胶盖于滤纸上，将膜盖于胶上，并除气泡。在膜上盖三张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫。
5.5 转膜条件（湿转）
5.5.1 快转。300mA恒流转膜半小时，或者200mA转膜1小时，时间可以略微调整，时间对应调整。
5.5.2 慢转。转膜过夜，25V恒压转膜过夜。
6 免疫反应
6.1 将转好的膜于室温下脱色摇床上用5%的脱脂牛奶(0.5%TBST配)，封闭1h。
6.2 稀释一抗（TBST溶解的5%脱脂牛奶，磷酸化蛋白使用TBST溶解的5%BSA），4℃孵育过夜（快转），或者4℃孵育抗体3小时（慢转）。
6.3 用TBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次5min
6.4 将二抗用TBST稀释3000倍，室温下孵育30min后，用TBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次5min
7 化学发光将ECLA和ECLB两种试剂在离心管中等体积混合，将PVDF膜的蛋白面朝上与此混合液充分接触，1-2min后，去尽残液，包好，放入暗匣中曝光。最后用显影、定影试剂进行显影和定影。根据不同的光强度调整曝光条件。
8 凝胶图像分析将胶片进行扫描存档，PhotoShop整理去色，Alpha软件处理系统分析目标带的光密度值。

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