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由南往北木虫 (正式写手)
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293T细胞蛋白胞内表达 已有4人参与
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大家好， 我是刚刚接触真核表达的小白一枚，由专业公司合成了一个真核表达质粒，使用ptt5载体，打算使用293T细胞进行表达。目的基因在NCBI上检索发现序列自身不带有信号肽，于是额外添加了一个适合在293T细胞分泌表达的信号肽；但是合成后的质粒并不能分泌表达，在胞内具有一定的表达量，所以当时合成公司认定此质粒不能用于真核表达，为失败。【该蛋白原核表达位包涵体，表达量lve低，但活性较好】 但是本人比较不信，于是收到“失败”的质粒后，我使用lipofectamine2000/3000分别进行了293T转染，使用双抗夹心ELISA检测发现细胞上清中有微量表达，大概40ug/L，胞内表达量相对较高，根据天然样本的检测推断可能有40ug/10^5细胞（一个10cm平皿）。包涵体纯化后蛋白质活性较原核表达低至少8倍。 那么，问题来了： 1、为什么合成公司认定胞内表达即为失败； 2、据我所了解的，基因信号肽主要作用是细胞内定位，那么没有信号肽说明该蛋白没有固定的表达位点？还是说它本身就是属于包涵体，不可作为分泌表达？ 3、额外添加了信号肽为什么不能使其分泌表达？ 4、真核胞内表达的蛋白纯化出来，经过复性也会严重损失活性吗？还是说胞内表达就已经开始丧失活性？ 蛋白是想用来做免疫原的！ 感谢各位的谈论指点，望大家实验科研顺利！ |
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3楼2020-05-15 18:32:26
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4楼2020-05-18 23:50:20
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5楼2020-05-19 08:00:51