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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 小白求助，比较啰嗦
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5点半起

新虫 (初入文坛)

[求助] 小白求助，比较啰嗦 已有2人参与

载体是PMD-19T，目的基因750bp。连接转化之后，用载体通用引物菌P，条带是在750bp处，为什么呢？菌P是P的目的基因，还是整个载体？还有，作为线性载体，和目的基因连接之后是环状的吗？

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1楼 2020-05-14 19:07:05
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GRUBBY_WU

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1.因为插入片度750bp，用载体上引物菌检pcr，条带略大于750bp
2.菌检当然是看是否插入了目的片段
3.是环状的

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2019更好更棒!
2楼2020-05-14 22:09:40
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cry_2013

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
载体和目的基因连接是双酶切或单酶切载体和目的片段后，各产生黏性末端或者平末端，然后连接起来。通用引物的上下游引物一般在载体多克隆位点两端附近，往载体上连片段用的是多克隆位点上的酶切位点，插入外源片段后用通用引物PCR检测结果大小就和外源片段相近。
你用的PMD-19T好像是已经线性化的载体，相当于已经在多克隆位点酶切开了，而且是两端都是黏末端载体，需要扩出来两端都是黏末端的片段（用Taq酶扩增）直接跟它连接，连起来就是个环状的。
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3楼2020-05-15 14:36:16
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匿名

用户注销 (职业作家)
本帖仅楼主可见
4楼2020-05-17 22:36:00
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