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5点半起

新虫 (初入文坛)

[求助] 小白求助,比较啰嗦 已有2人参与

载体是PMD-19T,目的基因750bp。连接转化之后,用载体通用引物菌P,条带是在750bp处,为什么呢?菌P是P的目的基因,还是整个载体?还有,作为线性载体,和目的基因连接之后是环状的吗?

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GRUBBY_WU

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
1.因为插入片度750bp,用载体上引物菌检pcr,条带略大于750bp
2.菌检当然是看是否插入了目的片段
3.是环状的

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2019更好更棒!
2楼2020-05-14 22:09:40
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cry_2013

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
载体和目的基因连接是双酶切或单酶切载体和目的片段后,各产生黏性末端或者平末端,然后连接起来。通用引物的上下游引物一般在载体多克隆位点两端附近,往载体上连片段用的是多克隆位点上的酶切位点,插入外源片段后用通用引物PCR检测结果大小就和外源片段相近。
你用的PMD-19T好像是已经线性化的载体,相当于已经在多克隆位点酶切开了,而且是两端都是黏末端载体,需要扩出来两端都是黏末端的片段(用Taq酶扩增)直接跟它连接,连起来就是个环状的。
3楼2020-05-15 14:36:16
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匿名

用户注销 (职业作家)

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4楼2020-05-17 22:36:00
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