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mei1532467

新虫 (初入文坛)

[求助] 考马斯亮蓝法测定蛋白含量疑问

我在做固定化酶相关的课题,最近想使用考马斯亮蓝法测定计算固定化后酶在载体上的负载量。结果实验数据有点反常理,无法解释,麻烦各位帮忙分析一下,问题出在哪里?
我的具体方法是,1号加入缓冲溶液、酶液和交联剂,2号加入未改性的原始载体、缓冲溶液、酶液和交联剂,3号加入aptes改性载体、缓冲溶液、酶液和交联剂,进行固定化反应,1、2、3号中所有加入的液体体积都是相同的。
固定化结束后,使用考马斯亮蓝法测定对比1、2、3号上清液中蛋白质含量。具体过程是,分别在试管中加入8ml考马斯亮蓝试剂和2ml上清液,2分钟后在595nm处测定吸光度,使用8ml考马斯亮蓝试剂和2ml缓冲溶液的混合液作为参比对照。事先使用待测蛋白质做了标准曲线,R2能达到2个9以上。
结果:3号上清液的蛋白含量是1号的3倍多,1号上清液中蛋白含量比2号高一点。特别是1号和3号对比,也就是说固定化后,上清液中蛋白含量没有减少,反而平白无故的增多了很多,这没法解释。
上清液往考马斯亮蓝试剂中加入的时候,肉眼就能看出差别,3号混合液马上变得非常蓝,而1号混合液的颜色变化不明显。1号上清液中蛋白含量的测定值,跟蛋白质称量溶解稀释后的计算值基本吻合,也就是说1号的测量值没问题的,但是3号经过固定化后,上清液中蛋白含量不减少,反而大幅增大,实在是有问题。我知道肯定是有地方出错了,但是我实在找不出原因,求助各位请帮忙分析一下,问题究竟出在哪里,谢谢了!
我也是第一次使用考马斯亮蓝法,也有几点疑问望各位一并解答,实验过程中我偶然间使用大量的缓冲溶液稀释考马斯亮蓝试剂,发现混合液马上变蓝,跟加入蛋白质一样,并且缓冲溶液ph越高,颜色就越蓝,这正常吗?还有考马斯亮蓝试剂应该是什么颜色的呢?我配制的是黑褐色,使用8ml考马斯亮蓝和2ml缓冲溶液配制参比液时混合液变成了暗绿色,当加入蛋白质时,会变成蓝色,这正常吗?
谢谢!

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allsw

木虫 (正式写手)

刚刚写错了 不是考马斯亮蓝R290,是R250. G290应该是G250
3楼2021-05-10 11:18:59
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allsw

木虫 (正式写手)

现在这个问题解决了吗?我也在用这个方法给蛋白染色,发现考马斯亮蓝G290就是这样的,酸度强的时候是褐色的,如果用水稀释,溶液是灰绿色的,再稀释就变成蓝色,我不知道用考马斯亮蓝R290会不会这样,我怀疑是我用错了染料的型号,所以我再买R290试试?你如果有新的进展,也和我讨论一下可以吗?
2楼2021-05-10 11:15:00
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