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mei1532467

新虫 (初入文坛)

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[求助] 考马斯亮蓝法测定蛋白含量疑问

我在做固定化酶相关的课题，最近想使用考马斯亮蓝法测定计算固定化后酶在载体上的负载量。结果实验数据有点反常理，无法解释，麻烦各位帮忙分析一下，问题出在哪里？
我的具体方法是，1号加入缓冲溶液、酶液和交联剂，2号加入未改性的原始载体、缓冲溶液、酶液和交联剂，3号加入aptes改性载体、缓冲溶液、酶液和交联剂，进行固定化反应，1、2、3号中所有加入的液体体积都是相同的。
固定化结束后，使用考马斯亮蓝法测定对比1、2、3号上清液中蛋白质含量。具体过程是，分别在试管中加入8ml考马斯亮蓝试剂和2ml上清液，2分钟后在595nm处测定吸光度，使用8ml考马斯亮蓝试剂和2ml缓冲溶液的混合液作为参比对照。事先使用待测蛋白质做了标准曲线，R2能达到2个9以上。
结果：3号上清液的蛋白含量是1号的3倍多，1号上清液中蛋白含量比2号高一点。特别是1号和3号对比，也就是说固定化后，上清液中蛋白含量没有减少，反而平白无故的增多了很多，这没法解释。
上清液往考马斯亮蓝试剂中加入的时候，肉眼就能看出差别，3号混合液马上变得非常蓝，而1号混合液的颜色变化不明显。1号上清液中蛋白含量的测定值，跟蛋白质称量溶解稀释后的计算值基本吻合，也就是说1号的测量值没问题的，但是3号经过固定化后，上清液中蛋白含量不减少，反而大幅增大，实在是有问题。我知道肯定是有地方出错了，但是我实在找不出原因，求助各位请帮忙分析一下，问题究竟出在哪里，谢谢了！
我也是第一次使用考马斯亮蓝法，也有几点疑问望各位一并解答，实验过程中我偶然间使用大量的缓冲溶液稀释考马斯亮蓝试剂，发现混合液马上变蓝，跟加入蛋白质一样，并且缓冲溶液ph越高，颜色就越蓝，这正常吗？还有考马斯亮蓝试剂应该是什么颜色的呢？我配制的是黑褐色，使用8ml考马斯亮蓝和2ml缓冲溶液配制参比液时混合液变成了暗绿色，当加入蛋白质时，会变成蓝色，这正常吗？
谢谢！

发自小木虫Android客户端

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