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victor_u

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专业: 蛋白质组学

[交流] 利用凝胶过滤层析纯化蛋白质的前期准备已有8人参与

凝胶过滤层析是利用具有多孔网状结构的颗粒的分子筛作用，根据被分离样品中各组分相对分子质量大小的差异进行洗脱分离的一项技术。
凝胶过滤层析（gel filtration chromatography）法又称为排阻层析或分子筛方法，主要是根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的质量进行分离和纯化。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖（如葡聚糖或琼脂糖）类物质，使蛋白质混合物中的物质按分子大小的不同进行分离。也叫做分子排阻层析（molecular-exclusion chromatography）。一种利用带孔凝胶珠作基质，按照分子大小分离蛋白质或其它分子混合物的层析技术。一般是大分子先流出来，小分子后流出来。凝胶过滤层析非常适合对pH变化、金属离子或辅助因子浓度以及大环境情况敏感的生物分子。
为了进行分离，将凝胶填料装柱形成柱床。填料是球状颗粒的多孔填料，根据其化学和物理稳定性以及惰性（没有反应性和吸附性）进行的选择。在分离过程中，样品用同溶剂进行洗脱，而在分离的后期，通常需要使用流动的缓冲液，以便移除柱子中残余的分子，使柱子可用于下一次分离。

样品制备
样品必须澄清，没有颗粒状物。
样品缓冲液：样品缓冲液的pH、离子强度和组成不会显著性影响结果的分辨率，只要这些参数不影响被分离蛋白质的大小和稳定性，也不超出填料的稳定范围。
样品浓度：凝胶过滤与样品质量无关，因此与样品浓度也没有关系。通常不要超过70 mg/mL蛋白浓度。样品的溶解性和粘度会限制样品浓度，关键在于样品相对于流动相的粘度，太高的样品粘度会引起分离的不稳定性和不规则的流动形式，这回导致非常宽和成串的峰形，反压也会增加。
样品体积：在凝胶过滤中，这是最重要的参数之一。

缓冲液组成和制备
在凝胶过滤中，缓冲液的组成不直接影响获得的分辨率，更重要的考虑是，缓冲液对目标蛋白分子的形状和生物学活性的影响。选择的缓冲液和pH需要使蛋白保持稳定性和活性，并且目的蛋白在其中能够收集。
注意在使用之前，缓冲液应当使用0.45微米或者0.22微米的膜进行过滤，在进行凝胶过滤之前，必须去除缓冲液中的气体。

而在凝胶过滤层析中，柱效尤为重要。由于分离过程中只有一个柱体积的缓冲液流过柱子，装柱柱床和颗粒的均一性影响流过柱子的一致性，因此影响峰形和最终的峰宽。高度均一的凝胶过滤填料有助于分子的窄峰洗脱。因此要尤为注意所用柱子的柱效。

做完准备工作后，就可以用 Union蛋白纯化仪进行样品纯化了。

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