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[交流]
【交流求助】肝癌组织蛋白降解了么？
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最近提取了一批肝癌组织蛋白样品，提好后保存于－20度，第二天做了个western，有明显的目的条带（45kd），过了2周，再用同一批样品同样做western，却发现没有目的条带了（内参也没有检测到，而阳性对照有条带），请教各位可能是甚么原因？难道是蛋白降解了么？照理说提取好的蛋白在－20度可以保存半年以上吧？而且应该也不是提取的问题，因为第一次western结果是好的。 我的提取方法如下： 1 组织蛋白提取 1） 将组织从-80℃冰箱取出，称重，放入离心管。按1ml/100mg加入蛋白裂解液。将离心管放入冰水混合物中使组织复温30min。 2） 冰浴匀浆，将组织打碎。 3） 冰浴静置30min后4℃离心，12,000g×15min。 4） -20℃保存。 2 SDS－PAGE凝胶电泳和蛋白质免疫检测 1） 改良Lowry法进行蛋白定量后，按蛋白量：2×SDS上样缓冲液：DTT比例为4：5：1处理蛋白。沸水煮10min，使蛋白质变性；4℃离心，12,000g×10min 蛋白裂解液：Tris-HCl（pH7.5，1M），5ml；EDTA（0.5M），1ml；SDS（10%），10ml；NP-40（nonidet p-40），1ml；Sodium deoxycholate，0.5g；CHAPS，3.69g；Triton X-100，1ml；去离子水加至100ml，临用前按1：50加入蛋白酶抑制剂CM(ROCHE) (或者按最后一个配方)。 0.5M EDTA （pH8.0）：EDTA-Na2·2H2O，18.6 g；去离子水，80ml；剧烈搅拌，用0.5 mol/L NaOH调pH至8.0，用去离子水定容至100ml。 蛋白酶抑制剂储存液： 100×PMSF （100mM）： PMSF 174 mg à 异丙醇 10 ml； 100×pepstatin （200μg/ml）：pepstatin 2 mg à 甲醇 10 ml； 100×leupeptin （500μg/ml）：leupeptin 5mg à去离子水10 ml； 100×aprotinin （500μg/ml）：aprotinin 5mg à去离子水 10 ml； 以上每种试剂按500μl×20分装，－70℃保存。 [ Last edited by sleepyabby on 2009-6-30 at 18:58 ] |
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