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关于293细胞培养的几点认识 已有1人参与
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培养293细胞对于熟练掌握细胞培养的人来说不是问题，但是对于小白来说总会出现这样那样的问题。而且一般遇到的也不是个别问题，大都是小白一开始都会遇到的普遍问题。所以，这个时候要尽可能的先考虑自身的操作是否规范，排除掉操作问题之后如果还没有解决问题，再考虑细胞本身的因素。 根据自己的经验，总结以下几点需要注意的地方： 一、首先293细胞养的好与不好关键的决定因素还是在于人，也就是操作者的细胞培养技术。有多年的细胞培养经验的人比新手当然比一样，大家都很认真，但是效果却不同，所以实验者的操作技能是决定性的因素。 二、293细胞培养时的细胞接种密度应大于一般的细胞，也就是能1瓶接种的就不要接种2瓶。 三、处置不要太过于频繁或积极，处理上冷淡些（也就是减少对它的过多刺激）反而回获得好的生长效果。 四、在细胞生长过度时再传代，一般的细胞长到80-90%即可传代，而293细胞长到100%甚至更高时传代有利于其生长和活力的保持。一般的细胞2天可传代，293细胞一般建议不少于3天。 五、并非只能用DMEM，像用1640这样的都可以，同样培养的很好。 293细胞培养特性： 一、293细胞明显适应酸性环境,pH值在6.9～7.1时,可顺利贴壁生长, 换液时动作要轻。一般用高糖的DMEM培养基。 二、传代：倒去废液，PBS洗一次（轻），用0.02%EDTA与0.25%Trypsin消化，生长良好细胞，培养瓶中轻摇,使之流遍所有细胞表面,即将其吸除或弃去消化30s，然后吸去，再让剩下的EDTA/Trypsin作用30s,镜下观察细胞变圆,就可加DMEM终止消化，反复吹打至细胞全成单个悬浮细胞即可。12小时-24小时90%以上细胞贴壁。293细胞传代时机为达80-90%汇合，传代比例为1：3。 三、293细胞在低代时容易贴壁，生长良好，在传到几十代以后，易聚集成团，且贴壁不牢，用PBS冲洗时即可能脱落，即使消化后也不容易吹打成单细胞悬液，最好购入时先大量冻存。 四、复苏 293细胞的另一生长特性是贴壁所需时间长且贴壁不牢。细胞冷冻后复苏时,都有不同程度的肿胀,若以50ml培养瓶待细胞长满瓶底的70%～80%时消化冻存,复苏时将其全部接种至2个50ml瓶中时较为合适。刚复苏的293贴壁很慢，复苏接种后24小时内,应尽量减少观察细胞次数或不作观察,以免因晃动而影响细胞贴壁。复苏后48小时左右观察贴壁情况并进行首次更换培养基比较合适,如果用一次性塑料培养瓶可增加细胞贴壁牢度。换液前宜将培养基预热。 五、转染：体外应用293细胞进行细胞转染时，如果是采用磷酸钙转染，一定要注意293细胞不要全部长满细胞培养盘，长满细胞时加入磷酸钙就会使293细胞大片的脱落，最好是当293生长到1/2或2/3时进行磷酸钙转染，可以避免细胞的大量脱落。 其它的经验： 一、用大瓶培养较小瓶要好，可能是更有利于293均匀的分布，利于营养的摄取 二、培养液要新鲜，每次只配1000ml，分为2-4瓶，不用的培养液，冻存在-20度， 三、要及时传代，最好是细胞基本铺满培养瓶底部，但是细胞之间还没有完全贴紧，总是多少有空隙的时候最好。 四、如果细胞贴壁不好，可能是消化过久，或是培养瓶不够干净，当然要除外细胞污染。 五、如果使用用玻璃培养瓶或皿，可以采用高压灭菌的0.2%明胶溶液预处理培养瓶/培养皿，方法是将明胶加入培养皿，使之浸泡到底面的各个部分，然后吸出，置超净台内晾干即可使用。这样处理后细胞贴壁效果好且镜下细胞立体感强。如果是新的塑料培养瓶就不用处理。 以上是我的实践经验之谈，若能对您有益将是我的心愿。 |
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