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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 蛋白可溶性表达 无活性
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yedansky

新虫 (著名写手)

[交流] 蛋白可溶性表达 无活性

有没有可能 大肠杆菌在OD600 0.4-0.6
诱导时，少量表达的可溶性蛋白 有很高的活性 但OD600 值在0.7-0.8或者更高，虽然为可溶性表达，但是无活性，有人有这种情况么

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1楼 2020-01-10 15:26:54
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zsygxh

金虫 (小有名气)
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西门吹雪170: 金币+5, 鼓励热心回帖交流 2020-01-18 20:28:23
关系应该不大。
1. 首先蛋白可溶并不代表蛋白处于天然结构，它可以是可溶性多聚体，也可以是多种结构的混合物，虽然没有沉淀，但有可能活性位点被包埋或活性位点的氨基酸侧链空间位置变化而没有活性，这跟蛋白性质有关，所以即使可溶活性也可能很低甚至无活性。
2. 蛋白可能存在必要的修饰才有活性，原核表达系统无法完成，查文献自行确认。
3. 缺乏辅因子，查文献自行确认。

建议纯化以后跑一下HPLC，先确认样品是否为单一结构。另外，确认一下序列里有没有cys，如果有确认cys是形成二硫键还是参与金属离子配位的，如果没有尝试融合不同标签表达。
总之，优先尝试通过可溶表达获得天然构象的蛋白，不行尝试复性。
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3楼2020-01-10 17:09:02
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旭日读书

铁杆木虫 (著名写手)
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绝对是自己哪里有问题

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2楼2020-01-10 16:01:09
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匿名

用户注销 (职业作家)
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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4楼2020-01-10 19:41:40
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zsygxh

金虫 (小有名气)
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2020-01-18 20:29:00
引用回帖:
4楼: Originally posted by sévérité at 2020-01-10 19:41:40
这么讲究，我的蛋白好多cys，我是不是要做好心理准备
...

可能有难度。大肠杆菌细胞质是还原环境，缺乏二硫键形成和异构的相关酶类，所以在胞内表达的蛋白是还原状态的，破菌后氧化形成二硫键的过程是随机的，也就会出现大量的分子内及分子间的错配交联。另外像锌指结构蛋白中cys不参与二硫键形成，而是与金属离子形成配位键，稳固空间结构的。如果这个蛋白的结构已经有人解出来的话，先明确一下cys的配对情况或空间位置。多cys的蛋白往往比较难做，可能会是持久战。建议尝试TrxB和gor基因突变的菌株表达，比如origami，rosetta-gami系列的菌株，或者尝试分泌表达，或真核宿主表达，实在不行就尝试复性。
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5楼2020-01-10 22:31:30
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