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端粒酶的提取
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| 刚刚做实验，不清楚从肿瘤细胞中提取酶的注意事项，具体的操作过程是如何的？需要什么试剂？如何让保存？ |
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yang0071
木虫 (职业作家)
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llxxdl620(金币+31,VIP+0): 6-19 17:15
llxxdl620(金币+31,VIP+0): 6-19 17:15
| 早期采用超声等物理破碎的方法在不同细胞中的提取效率差异较大，此后采用去污剂（如CHAPS）裂解的方法在少量细胞获取了较稳定的端粒酶提取液。现详述如下：40～100mg冷冻（-70％℃）组织或104～106沉淀细胞用冰预冷的洗液[10mM hepes-KOH(pH7.5), 1.5mM MgCl2, 10mM KCI, 1Mm DTT]洗1次，10000g4℃离心1min，沉淀加200μl冷裂解液[10mM tris-HCI(Ph7.5), 1mM MgC12,1mM EGTA, 0.1mM PMSF, 5mM β-巯基乙醇，0.5％CHAPS，10％甘油]，自动匀浆器冰浴中匀浆，450rpm,25min, 16000g4℃离心20min，移取上清160μl，部分样品用于蛋白定量，其余迅速冷冻，-70℃保存。端粒酶经小于10次冻融可保持活性稳定。部分学者对某些标本用0.5％Tween-20代替0.5％CHAPS获得更" 好的效果 |
2楼2009-06-18 14:48:46