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【原创】谁能告诉我怎样在血液的淋巴细胞中提RNA
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大家好，我是一个学分子生物学的，最近要在血液中的淋巴细胞中提取RNA，不知道如何提取，请做过有关方面实验的人能传授点经验。 我用宝生物的盒子没提出来，不知道是不是手法的问题，还有就是我想说，宝生物的catrimox-14的盒子中最后一步 （6）除去溶液，沉淀用70%的冷乙醇清洗一次。 （7）沉淀经过简单的真空干燥后，溶于适当缓冲液。 这个实在搞不明白，用冷乙醇清洗，冷乙醇是离心倒掉 还是放着真空干燥啊？还有就是真空干燥 怎么干燥，在dof管里怎么去干燥这个东西。 请做过这项实验的给个建议。谢谢了 |
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2楼2009-06-16 13:40:16
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3楼2009-12-18 02:17:52
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肝素抗凝的血液在4度我最长放了48小时仍可分离出单个核细胞做RNA抽提的。外周血不能直接来提取，一般用淋巴细胞分离液，分离出淋巴细胞，然后在提取RNA，一般5ml的外周血即可。 还可以用磁珠分离淋巴细胞来提取RNA。 从血液中提RNA的方式和试剂用量基本与从组织中一样。注意：血液中提RNA的含量很低，50ul血液中可以得到约0.5ugRNA,所以提取过程中,异丙醇沉淀RNA时,需要假如糖原.如果提出的RNA用于RT-PCR反映,血液抗凝是须用EDTA,而不能用肝素抗凝. 我的试验就包括提取外周血单个核细胞总RNA,EDTA-K2抗凝血，2~3ml足够了，新鲜血，最好不要超过4h,淋巴细胞分离液提取外周血单个核细胞，在用trizol提取RNA,注意整个操作过程中防止RNA的降解。 外周静脉血用EDTA抗凝，对提取的RNA影响小，一般3毫升就可以，每毫升血液含RNA约1---5ug，用淋巴细胞分离液分离，步骤和提取淋巴细胞一致，分立的细胞用0.3-0.5毫升TRIzol提取，效果比较好，RNA无论质和量都比其他方法好，操作过程中主要是防止污染，RNA酶尤其要注意，注意戴手套，无菌操作，最好能使用一次性试管和枪头。 用了肝素抗凝肯定对取的RNA有影响，外周静脉血最好用EDTA抗凝，对提取的RNA影响小，至于RNA量，5毫升提RNA应该够了，10ng-1ug用promega的RT-PCR试剂盒结果应该没问题。 1.加入与血液等量的PBS（或1640），用滴管混匀 2.在一支玻璃管中加入与血液等量的淋巴细胞分离液 3.将血液与PBS的混合物沿管壁加入淋巴细胞分离液上，注意不要破坏细胞分离液的液面。 4.2000rpm，20min 5.离心后分三层，用滴管吸取中间雾状层淋巴细胞。 6.加入4倍于淋巴细胞体积的PBS（或1640），混匀 7.1500rpm，15min 8.离心后，如有红色点（为红细胞），可加入灭菌水1ml，混匀后立刻加入3ml PBS（或1640），（速度要快，否则淋巴细胞也会破裂），然后1500rpm，15min 9.如果没有红点，加入适量PBS（或1640），然后细胞计数，至细胞数为5×10的六次方即可。2000rpm，10min。倒尽上清，沉淀即为淋巴细胞 1.加入750微升Trizol，静置5分钟 2.加入酚、氯仿-异戊醇各200微升，剧烈振荡，12000rpm，10min 3.取上层，加入200微升氯仿-异戊醇，剧烈振荡，12000rpm，10min 4.取上层，加入200微升异丙醇，此时有白色絮状沉淀，混匀至沉淀溶解，静置10-15min，12000rpm，10min，记住沉淀位置 5.倒去上清，用1ml的75％乙醇洗涤RNA（避开RNA位置，以免洗去RNA） 6.扣干，（但不要太干，以免降低RNA的溶解度），加入1ml 75％乙醇，-20度冻存 |
4楼2009-12-18 09:57:59
5楼2009-12-18 09:58:39
qqsvery
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6楼2009-12-19 15:28:41