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高产淀粉酶菌株的分离和酶提取制备
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| 刚工作参与本科生开拓性教学项目－《从环境中分离高产淀粉酶的菌株并制备淀粉酶》要求学生结题上交菌株和产生的淀粉酶；请虫友们帮忙指点一下我该如何开展此项工作，我没做过育种工作？谢谢 |
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冼亮淀粉酶
专家顾问 (知名作家)
生物大分子降解酶
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专家经验: +248 - BioEPI: 73
- 应助: 257 (大学生)
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- 注册: 2009-09-25
- 性别: GG
- 专业: 环境微生物学
- 管辖: 微生物
lichaowater(金币+1):xiexie 2010-02-08 10:45
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我写的文章，供参考 1.1.4 培养基 分离培养基、筛选培养基和PDA培养基均使用蒸馏水配制。 每升分离培养基[13]中含有: 10g可溶性淀粉、3g NaNO3、1g KH2PO4、0.5g KCl、0.5g MgSO4•7H2O、0.01g FeSO4•7H2O、25g琼脂；pH5.5。将配制好的培养基于15磅／英寸2的压力下湿热灭菌20分钟。 每升筛选培养基[14]中含有: 10g可溶性淀粉、2.5g (NH4)2SO4、3g KH2PO4、5g胰蛋白胨、0.2g MgSO4•7H2O、0.13g CaCl2、0.0255g FeSO4•7H2O；pH5.5。将配制好的培养基于15磅／英寸2的压力下湿热灭菌20分钟。 PDA培养基为中国检验检疫科学研究院北京陆桥技术有限责任公司生产，按照说明书配制，8磅／英寸2的压力下湿热灭菌20分钟。 1.2 方法 1.2.1 淀粉降解菌的分离和筛选 淀粉降解菌的分离和初步筛选：称取0.5 g土壤样品置于250 mL小锥形瓶中，加入20颗灭菌玻璃珠，加入50 mL灭菌水，180 rpm震荡60 min, 取悬浊液稀释为10-3、10-4、10-5、10-6、 10-7、10-8和10-9共7个稀释度，各稀释梯度取50 µL涂分离培养基平板，28℃恒温培养4天后，观察各平板菌落生长情况，选择生长真菌单菌落数量为10-15个的稀释度大量涂平板，28℃培养5天后用碘液染色，挑取有明显淀粉降解圈的真菌菌落稀释涂平板挑取单菌落作为复筛出发菌株。 淀粉降解菌的复筛：初筛获得的真菌取孢子制成浓度为1×107 个/mL的悬液，按照1%（V/V）的接种量接种至筛选培养基（500 mL三角瓶装液量100 mL）。在28℃和转速180 r/min震荡培养5天后取上清液在30℃下测定淀粉酶活力，选出淀粉酶在30℃下活力最强的菌株编号为真菌XX。 1.2.2 淀粉酶产生菌的鉴定 将淀粉酶产生菌接种到PDA平板上28℃培养5天，挑取少量菌丝于光学显微镜下观察孢子梗形态。把淀粉酶产生菌接种到筛选培养基中28℃和转速180r/min震荡培养2天，取新鲜菌丝体提取总DNA作为模板，用真菌通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATG-3′）PCR扩增其ITS序列[15]，扩增产物进行DNA序列测定，用测得DNA序列搜寻GeneBank。 1.2.3 淀粉酶酶学特性的初步研究 1.2.3.1 淀粉酶活力的测定 使用DNS(3, 5-dinitrosalicylate)法测定淀粉酶作用后释放的还原糖[16]。 在350 µL含0.25%（W/V）淀粉溶液的0.2 mol/L磷酸氢二钠-0.1 mol/L柠檬酸缓冲液中加入50 µL待测酶液，测定用温度下反应合适时间，加800 µL DNS试剂终止反应并沸水浴5 min显色，测定540 nm 的光吸收值，对照葡萄糖标准曲线来计算酶活力。 酶活力定义：每小时产生1mg还原糖所需的酶量为一个酶活力单位。 |
3楼2009-12-09 22:52:12
