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薄暮云朵

银虫 (初入文坛)

[交流] 求助:关于连接反应

为什么我每次把目的基因往载体质粒里连的时候,连出来的结果都是基因是反着插进去的,理论上说正向的和反向的连接产物应该是一比一才对,但我每次连的都是反向的,不管是平端连接还是粘性末端连接,我用过两种质粒,都是这样。想不明白原因,向高手求助。

[ Last edited by amisking on 2009-6-15 at 20:44 ]
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charlies929

至尊木虫 (正式写手)

★ ★
薄暮云朵(金币+1):谢谢参与
薄暮云朵(金币+1,VIP+0):谢谢 6-15 11:31
如果你是粘性末端连接应该是定向的才对啊!怎么会反向呢?
你是用T载体的吗?还是直接连接表达载体的呀?
平末端连接我做过送了2个正好一正一反。建议多送几个克隆肯定有正向的
2楼2009-06-15 11:29:39
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charlies929

至尊木虫 (正式写手)

对了,有次我RP值不高,送了第五个才是正向的,加油,平末端肯定可以筛到正向的。
3楼2009-06-15 11:31:23
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薄暮云朵

银虫 (初入文坛)

我做的是平端连接,测了十个,都是一个方向
4楼2009-06-15 11:33:16
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charlies929

至尊木虫 (正式写手)

我现在做的就是平末端连接,昨天测序结果就是送两个一正一反,你都是反的也太奇怪了,要看你的具体其情况了你能给我仔细讲讲么?你载体和外源片段都是PCR扩增得到的么?
5楼2009-06-15 13:36:24
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anik

银虫 (正式写手)


薄暮云朵(金币+1):谢谢参与
加接头,进行粘性末端连接
6楼2009-06-15 15:43:46
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dyyyyy

铁杆木虫 (著名写手)


薄暮云朵(金币+1):谢谢参与
该用不同的粘端吧
7楼2009-06-15 20:38:46
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xmchen1015

银虫 (小有名气)


薄暮云朵(金币+1):谢谢参与
可能你的基因正向连入载体时,会表达出对细菌有毒的蛋白。
如果你想要正向的,可以做一个菌落PCR,用载体引物和基因引物,这样可以筛到正向的,然后再培养提质粒
8楼2009-06-16 13:30:14
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