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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求助：关于连接反应
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薄暮云朵

银虫 (初入文坛)

[交流] 求助：关于连接反应

为什么我每次把目的基因往载体质粒里连的时候，连出来的结果都是基因是反着插进去的，理论上说正向的和反向的连接产物应该是一比一才对，但我每次连的都是反向的，不管是平端连接还是粘性末端连接，我用过两种质粒，都是这样。想不明白原因，向高手求助。

[ Last edited by amisking on 2009-6-15 at 20:44 ]
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1楼 2009-06-15 11:18:29
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charlies929

至尊木虫 (正式写手)
★ ★
薄暮云朵(金币+1):谢谢参与
薄暮云朵(金币+1,VIP+0):谢谢 6-15 11:31
如果你是粘性末端连接应该是定向的才对啊！怎么会反向呢？
你是用T载体的吗？还是直接连接表达载体的呀？
平末端连接我做过送了2个正好一正一反。建议多送几个克隆肯定有正向的
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2楼2009-06-15 11:29:39
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charlies929

至尊木虫 (正式写手)
对了，有次我RP值不高，送了第五个才是正向的，加油，平末端肯定可以筛到正向的。
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3楼2009-06-15 11:31:23
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薄暮云朵

银虫 (初入文坛)
我做的是平端连接，测了十个，都是一个方向
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4楼2009-06-15 11:33:16
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charlies929

至尊木虫 (正式写手)
我现在做的就是平末端连接，昨天测序结果就是送两个一正一反，你都是反的也太奇怪了，要看你的具体其情况了你能给我仔细讲讲么？你载体和外源片段都是PCR扩增得到的么？
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5楼2009-06-15 13:36:24
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anik

银虫 (正式写手)
★
薄暮云朵(金币+1):谢谢参与
加接头，进行粘性末端连接
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6楼2009-06-15 15:43:46
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dyyyyy

铁杆木虫 (著名写手)
★
薄暮云朵(金币+1):谢谢参与
该用不同的粘端吧
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7楼2009-06-15 20:38:46
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xmchen1015

银虫 (小有名气)
★
薄暮云朵(金币+1):谢谢参与
可能你的基因正向连入载体时，会表达出对细菌有毒的蛋白。
如果你想要正向的，可以做一个菌落PCR，用载体引物和基因引物，这样可以筛到正向的，然后再培养提质粒
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8楼2009-06-16 13:30:14
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