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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求助：大片段扩增
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yuhuimeiye

木虫 (著名写手)

[交流] 求助：大片段扩增

想从cDNA中扩增一3500bp的片段，可是一个多月了还是没有成功，希望好心人给点建议、谢谢
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1楼 2009-06-14 20:52:58
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shirley7216

木虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
用RT-PCR, DD-PCR 试剂盒合成
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simon
2楼2009-06-14 22:30:33
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thaw

铜虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
尝试一次啊分段扩，在SOE连起来
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3楼2009-06-15 09:02:13
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
amisking(金币+1,VIP+0):欢迎发帖交流！ 6-15 20:48
首先确认你的RNA提的质量如何
如果RNA本身已经降解，小于3.5kb，那么是不可能做出来的
其次是逆转录，M-MLV如果质量不好，3.5kb也是比较困难的
我建议使用SuperScript III
然后就是PCR这一步，酶的扩增能力很重要
Invitrogen的酶表现很稳定，推荐
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4楼2009-06-15 11:18:20
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yuhuimeiye

木虫 (著名写手)
以上方面我都注意过了，我还分段扩增，可是一直没有目的条带。
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5楼2009-06-15 19:56:02
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香菱儿

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by yuhuimeiye at 2009-6-15 19:56:
以上方面我都注意过了，我还分段扩增，可是一直没有目的条带。

那么是不是你提RNA的那个组织中，这个基因表达丰度太低呢？
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漫洒英雄泪，相离处士家。谢慈悲剃度在莲台下。没缘法转眼分离乍。赤条条来去无牵挂。那里讨烟蓑雨笠卷单行？一任俺芒鞋破钵随缘化！
6楼2009-06-15 20:10:17
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yuhuimeiye

木虫 (著名写手)
我western检测过，这个细胞中该基因表达量很高，不知道是不是我引物设计的问题，能否帮我设计一下，谢谢
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7楼2009-06-15 20:19:08
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