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yuhuimeiye

木虫 (著名写手)

[交流] 求助:大片段扩增

想从cDNA中扩增一3500bp的片段,可是一个多月了还是没有成功,希望好心人给点建议、谢谢
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shirley7216

木虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
用RT-PCR, DD-PCR 试剂盒合成
simon
2楼2009-06-14 22:30:33
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thaw

铜虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
尝试一次啊分段扩,在SOE连起来
3楼2009-06-15 09:02:13
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)


amisking(金币+1,VIP+0):欢迎发帖交流! 6-15 20:48
首先确认你的RNA提的质量如何
如果RNA本身已经降解,小于3.5kb,那么是不可能做出来的
其次是逆转录,M-MLV如果质量不好,3.5kb也是比较困难的
我建议使用SuperScript III
然后就是PCR这一步,酶的扩增能力很重要
Invitrogen的酶表现很稳定,推荐
4楼2009-06-15 11:18:20
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yuhuimeiye

木虫 (著名写手)

以上方面我都注意过了,我还分段扩增,可是一直没有目的条带。
5楼2009-06-15 19:56:02
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香菱儿

铁杆木虫 (著名写手)

引用回帖:
Originally posted by yuhuimeiye at 2009-6-15 19:56:
以上方面我都注意过了,我还分段扩增,可是一直没有目的条带。

那么是不是你提RNA的那个组织中,这个基因表达丰度太低呢?
漫洒英雄泪,相离处士家。谢慈悲剃度在莲台下。没缘法转眼分离乍。赤条条来去无牵挂。那里讨烟蓑雨笠卷单行?一任俺芒鞋破钵随缘化!
6楼2009-06-15 20:10:17
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yuhuimeiye

木虫 (著名写手)

我western检测过,这个细胞中该基因表达量很高,不知道是不是我引物设计的问题,能否帮我设计一下,谢谢
7楼2009-06-15 20:19:08
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