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维纳斯的骑士

金虫 (小有名气)

[交流] 一个做酿酒酵母的新手,请教大家了!

我是一个做酵母表达的新手,有很多地方需要请教,现在实验室给我一个青岛啤酒厂的啤酒酵母菌,需要做敲除整合染色体DNA,但我之前做的木瓜蛋白酶需要先克隆到一个表达载体上,然后我再用酶切或者PCR方法得到含有启动子,信号肽,木瓜蛋白酶,终止子以及两端同源臂的一个片段,最后整合入染色体做表达,可我不知道该怎么样选择表达载体可以得到上述片段,请大家指教指教,十分感谢!!!
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iaminxanadu

木虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
如果你知道你的酶已经在酿酒酵母里有功能了,可以直接用克隆载体。随便选了,最常用的pUC18。。。等你构建好了表达盒,设计带有靶位置同源序列的大引物,扩增表达盒后得到片断直接转化酿酒酵母单倍体, 涂木瓜蛋白平板?

或者先在靶位置插入一个显性筛选marker,比如卡那抗性,之后构建表达盒。。。。替换这个抗性marker 涂平板,影印或者挑菌落划半。。。
2楼2009-06-12 17:45:11
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