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【原创】求助：请教T7启动子引物的问题！急！
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最近PCR总是P不出来东西，很是着急，请教各位高人！！ 由于我需要在目的片段（337bp）前加上T7启动子以便体外转录，因此在设计的引物前加上了T7的序列，但不知为何一直没有条带？？是否是引物内部有二级结构呢？哪位大虾给我指点一下，不胜感激！！ 补充：用另一不带T7的引物就一直有条带！ 我的引物序列： F-T7(前段为启动子序列) 5' TAATACGACTCACTATAGTTTTGTTTGATGGAG 3' R: 5' GGGTCCTGTAGAGGAA 3' 我的反应条件： 94℃预变性2 min; 94℃，30 s，54℃，30 s，68℃，30 s （35个循环）;68℃延伸20 min。 另一个为： 94℃预变性3 min; 94℃，30 s，54℃，30 s，72℃，30 s （35个循环）;72℃延伸5 min. 但这两个条件都P不出来。 反应体系为：25μL PCR扩增体系为：10×DNA Polymerase 缓冲液2.5μL，10mM dNTP 0.5μL，上游引物/下游引物（浓度为10μmol/L）各0.5μL，rTaq 0.125μL，加ddH2O至25μL；质粒模板1μL； 请大家帮忙找找原因啊，非常感谢！！ [ Last edited by bbcc-2003 on 2009-6-11 at 11:05 ] |
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