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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 基因测序求助，分段式测序后拼接是否合理？
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wjb6681393

金虫 (小有名气)

[交流] 基因测序求助，分段式测序后拼接是否合理？

有一段序列A通过5端和3端设计引物，始终不能扩增出来，但通过将此段序列分割成多段(B,C,D,E)进行扩增，然后拼接获得目的序列A。   在不知菌株中是否有以上A序列的前提下，以上采用分段后拼接的方法是否有效？是否存在以上B,C,D,E在基因组的不同区域的可能性。
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1楼 2019-12-02 22:54:19
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liuqiang68

至尊木虫 (文坛精英)
★
wjb6681393(金币+1): 谢谢参与
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10楼2019-12-03 08:20:47
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炼水燎原

新虫 (小有名气)
★
wjb6681393(金币+1): 谢谢参与
首先你应该检查A的引物，有没有问题
像你这种情况我会优先考虑巢式PCR，而不是分段
另外，不知道你的A总共多长，你也可以先把小片段分别装平端载体测序，如若成功，再以质粒扩增，先拼接A全长。如果融合PCR失败，可以直接infusion
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21楼2019-12-06 19:18:03
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ap372767129

铁虫 (正式写手)
★
wjb6681393(金币+1): 谢谢参与
pcr扩增不出来你需要确定一下你的引物tm值，不能太高也不能太低，60左右是最稳的。然后pcr过程中淬火温度拉个梯度，55、58和60。你可以用菌落pcr方法p十个菌，一起跑电泳，看看哪个有条带，说明那个菌里有你需要的基因序列。

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22楼2019-12-08 15:14:09
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tzynew2楼
2019-12-02 23:25   回复  
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drum3楼
2019-12-02 23:37   回复  
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xiaoqiuqiu204楼
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syhorchid5楼
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solarzhao6楼
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nono20097楼
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wzh3148楼
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gongzilu9楼
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hikingman11楼
2019-12-03 08:36   回复  
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xiaoshuang112楼
2019-12-03 08:44   回复  
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假大空13楼
2019-12-03 08:54   回复  
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顶
skyhawk00614楼
2019-12-03 08:55   回复  
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psylhh15楼
2019-12-04 21:24   回复  
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BiotageAB16楼
2019-12-05 16:27   回复  
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solarzhao17楼
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syhorchid20楼
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guanlianwu23楼
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bjdxyxy24楼
2020-09-12 22:53   回复  
wjb6681393(金币+1): 谢谢参与
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bjdxyxy25楼
2020-09-17 08:08   回复  
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