24小时热门版块排行榜    

查看: 238  |  回复: 8
当前主题已经存档。
当前只显示满足指定条件的回帖,点击这里查看本话题的所有回帖

lyn0510

至尊木虫 (著名写手)

[交流] 20金币求助片段拼接

实验得到全长基因的四个片段,四个片段拼接起来就能得到全长基因,每个片段在1K左右,片段两两之间有100-300的同源区域,尝试用OVER-LAP PCR的方法拼接,但没有连上,求高人指点,如果能做出,再给金币,并深深感谢!
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lyn0510

至尊木虫 (著名写手)

不是序列的拼接,是实际的PCR产物的拼接,拼出基因全长后还要做表达的,序列的拼接已经知道了的,谢谢,继续求助
3楼2009-06-09 20:51:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 9 个回答

shamoyuji

木虫 (正式写手)

NCBI上有序列并接的,到那里试一试~我上次是在那里并接的。
2楼2009-06-09 20:45:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wufengjian

木虫 (正式写手)

我之前连过三个片段,用的就是Over-lap.
先将前两段1,2拼接,再将后两段3,4拼接,最后再将两个拼接好的片断接上。具体做法,比如拼接前两个片段1,2时:先将两个片段的首尾分别设计引物,放在一个体系中,第一个片断的5‘-3’引物多加点,第二个片断的3‘-5’引物多加点;这样使不对称PCR和OVER-Lap PCR 同时进行,退火温度可以放的低一点,你有几百个碱基德互补,应该非常好做。最后切胶回收。同理适用于其他片段。
祝实验顺利。
4楼2009-06-10 08:37:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lyn0510

至尊木虫 (著名写手)

非常感谢,具体引物浓度用多少比较合适呢?还有退火温度你是在多少的时候P出来的?谢谢!
5楼2009-06-10 21:09:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通表情 高级回复 (可上传附件)
信息提示
请填处理意见