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新虫 (正式写手)

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[交流] 细胞转染实验注意事项之质粒与转染试剂的选择

有的初学者习惯按照说明书123地去操作而不求甚解，你“知其然”是否还“知其所以然”呢？

启动子的选择对于转染基因的有效表达是非常重要的。对于转染过程本身虽然无甚影响，但是对转染结果却有着微妙的影响。

如果你的目的基因正好会影响选定细胞株的生长，甚至有毒，那最好选择一个诱导型的启动子，不然你可能总是转染不了。但是通常在实验之前我们不清楚我们研究的基因产物是否对选定的细胞有毒，所以正负对照很重要。当排除其他原因后转染总是失败，应当从根本上考虑原因。

质粒的大小和质量:

线性化还是超螺旋会影响转染结果：超螺旋质粒的转染效率比线性DNA高得多，特别是瞬时转染。而线性化DNA转染的整合几率高。质粒太大了转染会困难一些。毕竟，相对致密、较小的外源异物被细胞内吞的几率要大一些。如果你的质粒正好比较大，又没有经验，选择特别注明可以转大质粒的转染试剂成功几率会高一些。有的转染试剂还会提供一些促进DNA凝聚的成分，使得DNA形成转染复合物时更致密一些，更容易转染一些。

纯化质粒的质量无疑会影响转染效率。哺乳动物细胞总归是比大肠杆菌娇气，转染难度高些，因而要求的DNA纯度要更高些。早年要做转染真是大阵仗啊，光是提质粒做超离就令人皱眉。最令人头疼的是内毒素了。内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁上特有的成分，主要是脂多糖中的类脂A（lipopolysaccharides），在细菌被裂解时被释放出来，由于其化学结构和特性，在质粒提取的过程中内毒素很容易混入质粒DNA中共同纯化出来。内毒素的存在会严重地影响转染效率，此外内毒素可能会激活造血细胞（例如B细胞、巨嗜细胞等）的非特异免疫反应，造成实验中的假阳性。所以质粒DNA转染时应尽量采用无内毒素污染的超纯质粒。幸好技术的进步令复杂的操作成为过去，多数实验室会选择使用转染级别的质粒纯化试剂盒纯化的质粒来转染。对于一些“耐受性高、容易操作的”细胞株，普通的Kit已经够了。对于一些对内毒素特别敏感的细胞，就要用“去内毒素”的质粒纯化Kit了。

质粒DNA的浓度和量：

既然质粒纯化已经不成问题，初学者通常都不会在乎甚至愿意多加点DNA，但是要注意的是，DNA量过少固然转染效率不高，DNA量过多同样会降低转染效率。

DNA:转染试剂的比例的优化是非常重要的，特别是对于阳离子脂质体、多胺等带电荷的转染试剂来说，DNA-转染复合物所带的净电荷是由转染试剂和DNA的比例决定的，而转染复合物是否能更好地结合到带负电的细胞膜上，很大程度取决于这个净电荷。所以预实验需要按照说明书的要求，按一定比例混合适量的质粒DNA和转染试剂。

有的转染试剂要求DNA的量多些，有的转染试剂效率高只要很少DNA。所以转染前最好能精确定量质粒。另外由于质粒本身的因素（比如目的基因产物是否有毒、启动子强弱等因素），单独DNA也会对细胞生长有一个基础的影响，所以同时做几组不同量的对照实验进行优化是很有帮助的。另外值得注意的是，当细胞铺板密度较高时，需要的质粒DNA和转染试剂的量也会略微提高。

RFect Plasmid DNA Transfection Reagent具有非常卓越的转染性能，可高效转染多种贴壁细胞、原代细胞和悬浮细胞，转染效率在贴壁细胞中高达90%以上（EGFP质粒）。RFect Plasmid 不仅可转染较大分子的质粒DNA，还可转染RNA和小分子DNA。与目前市场上常见的脂质体转染试剂不同，RFect Plasmid 采用生物可降解材料配制，对细胞的毒性很低，转染后细胞死亡率不到10%。RFect Plasmid 使用也非常方便，先将转染试剂与质粒DNA混合，再将转染试剂-DNA复合物直接加入培养细胞中，血清不影响其转染效果，不必刻意添加或更换培养液，操作十分简便。

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