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请教细胞消化法传代步骤
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请教细胞消化法传代过程，越详细越好，不甚感激！ [ Last edited by 350784478 on 2009-8-15 at 15:05 ] |
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二、胰蛋白酶处理分离细胞 以单层细胞方式生长的细胞分泌细胞外基质和勃附蛋白以附着于生长表面:经典的 细胞传代和收集方法为采用胰蛋白酶处理细胞。胰蛋白酶是一种能够破坏基质和戮附蛋 白的蛋白水解酶。各种细胞系附着于生长物表面的豁附程度各不相同，这种差别在年轻 的人二倍体成纤维细胞和衰老的细胞中相差显著。衰老的成纤维细胞薪附于牛长物表面 更牢固，需要较强的胰蛋白酶作用。为了达到松弛细胞间连接和蛋白水解酶能够深人至 单层细胞的侧面及基底面，在进行胰蛋自酶处理前去除血清、钙及镁离子是非常重要 的;，某些细胞系叮采用二价离子鳌合剂如EDTA或h;GTA进行传代.:有时C:a2、M扩‘的 赘合可恰当地使细胞从基底层和细胞间分离开，但是多数细胞需要再加人胰蛋自酶一某 些细胞系需要的胰蛋白酶浓度为。. 2S }`}，然而过度胰蛋白酶处理可导致细胞的裂解和 活力的丧失。生长密度过高的细胞不易弥散成单个细胞悬液，为了得到适合于进行克隆 和细胞计数的细胞悬液，可在低密度条件下进行细胞传代数次，并在细胞连接成片前收 集细胞。 刮除法收集细胞 对少数细胞系，可以采用刮子进行机械分离，刮子是一种有一斜边和一个把柄的装 置。多数刮下来的细胞活力通常极低，但是某些细胞系在用EIYi A处理后(而不是胰蛋 白酶)能再刮下来。EDTA是一种二价鳌合剂，它能使细胞变圆并降低细胞对生长物表 面的薪附程度。对许多实验而言，尤其是进行细胞提取实验，在含有促进细胞裂解的和 适当蛋白酶、核酸酶抑制剂的缓冲液中用刮子刮取细胞，其优点是能迅速将细胞刮取于 少量裂解缓冲液中。从细胞中分离细胞核的第一步经常采用刮除法二 (一)单层细胞的胰蛋白酶处理 下述方案描述的是采用胰蛋自酶处理细胞，进行细胞的传代或收集。维持细胞系的 方法通常为侮周传代一次，在传代的前一天换培养液;但是某些细胞系需要更频繁的传 代。每种细胞系应单独传代以免细胞系交叉污染:超净工作台内不能同时放置一个以上 细胞系。 1.)吸干培养单层细胞的细胞培养瓶或培养.皿中的培养液。 2)加人O.OSalo胰蛋白酶工作液(}'-}5细胞培养瓶加人1 inl ; T-75细胞培养瓶加入 3mI )。 |
2楼2009-06-09 12:06:43
交流了
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将你培养的细胞从培养箱内取出，放入超净工作台中心，点燃酒精了 1.打开瓶口倒掉原液，然后加入等量PBS冲洗三次 2.加入消化液消化放入培养箱内（一定要擦干净） 注：如果消化时间短1-2min可以不用放进去（影响不大），如果消化时间长的话就放入培养箱内 3.消化时间到了就取出瓶子立起来，从细胞贴壁的反面倒掉消化液 4.加入等量的一半培养液在轻轻摇一下（中止残留消化液消化）倒掉 5.加入等量培养液轻轻吹打啊，如果熟了就不会吹打出来气泡了， 6.细胞悬浮了就传入别的瓶子，一般是一瓶传两瓶或者三瓶（长的比较好的话等长满可以冻存一管） 7.由于传代液体减半或为原来的三分之一，所以补满原等量的培养液 8.传代完毕就放进培养箱。 注：每次换液都要烧一下瓶口，移液枪枪管一定要用酒精擦一下，因为移液器进入培养液的瓶子（我们用生理盐水瓶配液体）里时会不小心将枪壁碰到瓶口。明白了？ 无菌操作就不会有多大问题了，加油啊。 （完） |
3楼2009-06-09 12:08:56
4楼2009-06-09 12:12:04
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5楼2009-06-09 12:41:53
三磷酸腺苷
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6楼2009-06-09 17:05:28
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