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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » pcr拖带
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xydlengyue

金虫 (正式写手)

[交流] pcr拖带

最近在做基因敲除  用引物跑上下游同源臂都能跑出来预计条带 胶回收上下游同源臂后 再以上臂正向引物和下臂反向引物做引物 上下同源臂回收胶为模板 跑pcr  然后拖带很严重  求教什么原因
来个大佬
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1楼2019-10-24 17:47:51
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安静de执着14

新虫 (著名写手)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2019-10-29 22:48:34
引用回帖:
4楼: Originally posted by xydlengyue at 2019-10-25 10:00:27
就是这种  是浓度高了吗

...

这种情况，可能是你的退火温度不合适，你的目的条带多大，模板多大？DNA模板浓度多大？多少个循环？你这些都没说，很难判断究竟是什么原因。

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5楼2019-10-25 12:38:24
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刘小小香

新虫 (小有名气)
★
xydlengyue(金币+1): 谢谢参与
那你直接胶回收的就可以用，为啥还要作为模板扩增呢？

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7楼2019-10-25 12:48:44
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普通回帖

安静de执着14

新虫 (著名写手)
★ ★
xydlengyue(金币+1): 谢谢参与
myprayer: 金币+1, 鼓励发帖积极交流，为分子生物板块发展助力。 2019-10-24 19:51:36
可能是目的DNA浓度太高。

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2楼2019-10-24 17:55:08
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xydlengyue

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 安静de执着14 at 2019-10-24 17:55:08
可能是目的DNA浓度太高。

就是这种  是浓度高了吗
pcr拖带



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4楼2019-10-25 10:00:27
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xydlengyue

金虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 刘小小香 at 2019-10-25 12:48:44
那你直接胶回收的就可以用，为啥还要作为模板扩增呢？

胶回收上下臂  这是要把上下臂连起来 不一样啊
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8楼2019-10-25 15:57:44
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刘小小香

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by xydlengyue at 2019-10-25 15:57:44
胶回收上下臂  这是要把上下臂连起来 不一样啊...

那就是胶回收后做融合PCR吗

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10楼2019-10-26 09:15:00
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xydlengyue

金虫 (正式写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 刘小小香 at 2019-10-26 09:15:00
那就是胶回收后做融合PCR吗
...

是的 但是一直是拖带
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12楼2019-10-28 22:25:16
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刘小小香

新虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by xydlengyue at 2019-10-28 22:25:16
是的 但是一直是拖带...

融合的话严格按照片段长度和浓度进行比例的加入，prime Star做的，基本没有问题

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13楼2019-10-29 14:41:56
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KM石头

金虫 (正式写手)
★
xydlengyue(金币+1): 谢谢参与
你用的是什么酶扩增的？重叠PCR要求是高保真酶，还有你重叠区的序列多长，建议20左右；你这个看上去像模板摩尔质量过多，可以将模板稀释一下(具体情况酶的说明书上会有)，此外可以不加引物先扩增10循环，等冷却下来再加入引物扩增30循环(该方法可能有效果)

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15楼2019-10-30 11:03:12
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psylhh3楼
2019-10-24 19:40   回复  
xydlengyue(金币+1): 谢谢参与
miaojiabing6楼
2019-10-25 12:48   回复  
xydlengyue(金币+1): 谢谢参与
tzynew9楼
2019-10-25 22:04   回复  
xydlengyue(金币+1): 谢谢参与
Genifer11楼
2019-10-28 13:40   回复  
xydlengyue(金币+1): 谢谢参与
youngen14楼
2019-10-30 09:19   回复  
xydlengyue(金币+1): 谢谢参与
nono200916楼
2019-10-30 14:57   回复  
xydlengyue(金币+1): 谢谢参与
·
Genifer17楼
2019-10-31 09:07   回复  
BiotageAB18楼
2019-11-07 17:21   回复  
xydlengyue(金币+1): 谢谢参与
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