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使用超声破碎细胞提取膜蛋白，破碎时间多久合适？ 已有1人参与
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最近在做UGT等位基因重组酶活性的实验，现在的问题重组的质粒转染细胞后，超声破碎细胞提取蛋白分别进行WB和体外孵育实验，WB能看到蛋白表达，但是体外孵育后进行HPLC检测，无论如何都检测不到代谢峰，孵育体系是参照文献来的，阳性对照能看到代谢峰，全程也都是在冰上操作，现在怀疑是我的酶在破碎时就降解了。 超声破碎时间文献上给的差异非常大，总结了一下大概有三种： 1.工作3s，冷却休息1min，振幅70%，总时间2min 2.工作5-8s，冷却休息10-20s，3-5个循环 3.工作30s，冷却休息1min，3个循环 想问问大家以上三种方法哪个可行呢？ 前两个和第三个的工作时间差的有点多，第三篇是外文文献原话是 prepared by sonication of cells in10mM Tris buffer for three30-s bursts, each separated by a 1-min cooling on ice，是不是我理解的有问题…… 我之前参考的第一种，单位的超声破碎仪型号比较老，不能设置振幅，我进行了4个循环，有没有哪位大神知道这钟老式型号的超声波破碎仪振幅怎么能控制呢？请有经验的大家帮帮忙！不胜感激！谢谢！  |
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Fishsh
新虫 (初入文坛)
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5楼2019-12-11 11:31:05
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2楼2019-10-21 17:28:32
3楼2019-10-22 16:03:10
【答案】应助回帖
感谢参与，应助指数 +1
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楼主你好，我自己做植物线粒体膜蛋白研究。我做过线粒体膜蛋白的超生分离。 根据你的描述，我认为如果WB能检测到你的目的蛋白表达，那说明你的超声步骤问题不大，有可能是在体外孵育的步骤发生了蛋白质降解。可以加一些蛋白酶抑制剂如Protease Inhibitor cocktails或者PMSF（注意，PMSF在水基容液中的稳定性很差，半衰期很短，时间长了会降解）。 如果你还是担心超声有问题，可以在你的超声Buffer里加入上述蛋白酶抑制剂。 超声参数其实是因仪器而异的。如果使用的不是同样的仪器，只能起参考作用。 并且，关于超声功率的问题，是和你所用的超声探头有关。 超声过程对蛋白质稳定性的主要影响就是发热，可以适当增加在冰上冷却暂停的时间并减少一次超声的时长。 而且，最好超声的过程中让样品一直在冰上。 如果你超声过程中样品一直起沫，那是由于你的样品体积相对于你使用的超声功率来说太小。 可以先用1 mg/ml 的BSA水溶液进行测试，找到最适合你目前使用的超声仪的容液体积。 而且，你的样品最好也稀释到mg/ml的浓度进行超声。 预祝试验成功，有问题欢迎讨论  |
4楼2019-10-23 20:31:00